【原】單細(xì)胞圖譜細(xì)化結(jié)直腸癌的分類

健明 2023-03-22 發(fā)布于廣東

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前言

文章題目：Refining colorectal cancer classification and clinical stratification through a single-cell atlas
日期：2022-05-11
期刊：Genome Biology
鏈接：https://genomebiology./articles/10.1186/s13059-022-02677-z

摘要

結(jié)直腸癌 (colorectal cancer, CRC) 是世界上第三大最常見的癌癥,，大約三分之一的患者在根治性手術(shù)切除和化療后出現(xiàn)復(fù)發(fā),。目前只有少數(shù)治療被批準(zhǔn)治療少部分特定的CRC患者，例如針對(duì)微衛(wèi)星不穩(wěn)定 (MSI-H) 腫瘤中的免疫檢查點(diǎn)抑制劑以及針對(duì)BRAF V600E mutant 的CRCs使用聯(lián)合 EGFR/BRAF抑制劑,。

大量研究表明,，間質(zhì)和免疫細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞和細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞可能是臨床效果的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素,。腫瘤微環(huán)境 (TME) 內(nèi)異型細(xì)胞多樣化的相互作用控制著其腫瘤生物學(xué),，進(jìn)而控制著 CRC 的臨床表型。

目前基于大規(guī)?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)對(duì)CRC進(jìn)行了分子分型,，發(fā)布了consensus molecular subtypes (CMS)，并將CRC分為了 CMS1（MSI 免疫）,、CMS2（典型）,、CMS3（代謝）和 CMS4（間充質(zhì)）。不過目前基于PD-L1/TGF-? expression signatures對(duì)患者進(jìn)行分型篩選（尤其是針對(duì)CMS4亞型的篩選）由于無效被終止,，這意味著 CMS 不能完全反映結(jié)直腸癌的生物學(xué)多樣性,。因此，應(yīng)該將CMS作為進(jìn)一步研究的基礎(chǔ),，發(fā)掘新的生物標(biāo)志物,。

作者試圖了解腫瘤上皮細(xì)胞,、間質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的細(xì)胞群如何塑造 CRC圖譜，發(fā)現(xiàn)了影響每個(gè) CMS 組中免疫和基質(zhì)細(xì)胞浸潤的腫瘤細(xì)胞的獨(dú)特內(nèi)在特征,。

單細(xì)胞聚類分群

作者拿到了16個(gè)不同種族,、未接受過治療的CRC患者組織和7個(gè)癌旁正常結(jié)腸組織樣本進(jìn)行scRNA-seq，得到了49589個(gè)細(xì)胞,，聚類分群得到：

epithelial cells (EPCAM+, KRT8+, and KRT18+), fibroblasts (COL1A1+), endothelial cells (CLDN5+), T cells (CD3D+), B cells (CD79A+), and myeloid cells (LYZ+) based on canonical marker genes

之后為了解析每種分子亞型的腫瘤及微環(huán)境的組成,，作者又進(jìn)行了細(xì)分，得到了49個(gè)亞群,，包括了免疫,、基質(zhì)和腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞的分布主要根據(jù)不同的患者,，也證明了患者間存在的異質(zhì)性,。另一方面，基質(zhì)和免疫細(xì)胞則按照不同的細(xì)胞類型各自聚集,，患者的來源對(duì)它們的分布影響不大,，表明幾乎沒有批次效應(yīng)。

腫瘤上皮細(xì)胞的不同CMS組之間的異質(zhì)性

目前不清楚癌細(xì)胞的內(nèi)在機(jī)制是否會(huì)對(duì)不同CMS組的基質(zhì)和免疫浸潤產(chǎn)生影響,，作者又拿到了其他已發(fā)表的數(shù)據(jù)集和自己的組合起來,，總共得到38 samples (N?=?7,530 tumor cells），之后再分成不同的CMS亞型,。經(jīng)過批次校正和歸一化后,，作者進(jìn)行了差異分析和富集分析。

發(fā)現(xiàn)不同CMS組之間存在明顯的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄層面差異：

CMS1 腫瘤上皮細(xì)胞主要富集在免疫,、蛋白酶體,、JAK-STAT 和 PD-1 信號(hào)通路
CMS4 腫瘤上皮細(xì)胞主要富集在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)、VEGF 和 TGF-β 激活等通路
CMS3 和 CMS4 腫瘤上皮細(xì)胞富集到了 Wnt 通路,，而Wnt活性從結(jié)腸隱窩區(qū)域的基部到其他分化區(qū)域呈現(xiàn)遞減,，表明CMS亞型與結(jié)腸隱窩的位置有關(guān)
CMS2 腫瘤上皮細(xì)胞高表達(dá)了因MYC 和 DNA 修復(fù)基因拷貝數(shù)改變而驅(qū)動(dòng)的基因；此外,，CMS2 與調(diào)節(jié)代謝和細(xì)胞周期的多種途徑相關(guān),，證實(shí)CMS2是各種 CMS 亞組中異質(zhì)性最強(qiáng)的

在腫瘤上皮細(xì)胞內(nèi)，多個(gè)關(guān)鍵通路如血管生成,、炎癥,、WNT 通路激活在 CMS 亞組之間均存在，作者假設(shè)這可能是由于腫瘤內(nèi)細(xì)胞分化產(chǎn)生的瘤內(nèi)異質(zhì)性,。于是使用了Monocle 2 和 Slingshot分別進(jìn)行驗(yàn)證,。發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性與 CMS 分型沒有相關(guān)性，瘤內(nèi) CMS 異質(zhì)性在 CRC 腫瘤中普遍存在,。這個(gè)結(jié)果和前人研究矛盾,，他們認(rèn)為腫瘤上皮細(xì)胞是沿著CMS亞型呈軌跡排列的,。于是作者重新對(duì)他們的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，剔除掉低質(zhì)量細(xì)胞以后發(fā)現(xiàn),，依然是沒有沿著CMS亞型呈軌跡排列的結(jié)論,。

腫瘤微環(huán)境中CAF 的不同表型

目前研究已經(jīng)確定了 CRC 微環(huán)境中癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 (CAF) 的相互作用，但沒有研究過單細(xì)胞水平上CAF異質(zhì)性和CMS之間的關(guān)系,。作者對(duì)fibroblasts重新分群后得到：adhesion/wound healing/CAF-S1, perivascular/CAF-S4 subtype

CAF-S1s表達(dá)了成纖維細(xì)胞的特有marker基因：FAP, PDPN, PDGFRA,；它可以繼續(xù)細(xì)分為：

(a) myo-fibroblastic (myCAF) (enhanced expression of collagen-related genes (COL1A1 and COL1A2) and fibroblast markers (FAP, PDPN)
(b) inflammatory (iCAF) subtypes (express chemokines such as CXCL12)

之前關(guān)于乳腺癌 (BC) 的研究發(fā)現(xiàn)CAF-S1 可以進(jìn)一步細(xì)分為至少五個(gè)亞型。為了探索CRC 中是否存在這五種亞型中的任何一種,，作者來自 BC 隊(duì)列的 18,296 個(gè) CAF-S1 細(xì)胞和 4685 個(gè) CRC CAF-S1 細(xì)胞，然后將 CRC CAF-S1 細(xì)胞與 BC 隊(duì)列中的細(xì)胞進(jìn)行了比較,。通過比較 BC 和 CRC 之間的差異表達(dá)基因,，確定了 CRC 患者的所有五種不同的 CAF-S1 亞型：ecm-myCAF（GJB；ANTXR1和SDC1）,、wound-myCAF（SEMA3C,；ANTXR1和CD9）、TGF ? -myCAF（CST1,；TGF?1,；ANTXR1和LAMP5）、IL-iCAF（SCARA5,；DLK1）和 detox-iCAF（ADH1B,；GPC3）

CRC的骨髓細(xì)胞亞群

作者將骨髓細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行分群，得到 CD1C+ 樹突細(xì)胞,、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（C1Q+ TAM,、MRC1+）、單核細(xì)胞（S100A8+）和粒細(xì)胞亞群,。單核細(xì)胞表現(xiàn)促炎特征（1L1B,、S100A8、S100A9）,，而 TAM 表現(xiàn)抗炎（APOE,、SEPP1、CD163）特征,。

C1Q+ 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞不僅在 CMS1 中富集,，而且在 CMS4 中富集，在CMS2 和 CMS3 亞型之間沒有差異,。據(jù)報(bào)道,，C1Q+ TAM 會(huì)影響腫瘤中的 CD8+ T 細(xì)胞富集，而 TAM 中的 Mettl14 或 Ythdf2 缺陷會(huì)通過減少細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞浸潤和促進(jìn)有缺陷的 CD8+ T 細(xì)胞積累來阻礙腫瘤緩慢發(fā)展,。有趣的是,，與 CMS1 相比,，CMS4 中的 CD8+ 的特征基因表達(dá)量更低?？傊?，作者發(fā)現(xiàn) C1Q+ 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在 CMS1 和 CMS4 中富集，CD8 T細(xì)胞效應(yīng)子在 CMS4 中減少,，很可能與 Ythdf2 缺陷有關(guān),。如果在表現(xiàn)出這些特征的 CRC 腫瘤中靶向 C1Q+ TAM 可能會(huì)增強(qiáng)免疫療法，并可能改善患者的預(yù)后,。

CAF 和 TAM 調(diào)節(jié) CRC 中的免疫抑制

作者使用cellphoneDB發(fā)現(xiàn)CAF 和 C1q+ TAM 的相互作用會(huì)影響T 細(xì)胞功能障礙和M2（另類活化巨噬細(xì)胞）的極化,。這些配體/受體介導(dǎo)的作用主要涉及免疫檢查點(diǎn)（CD40LG:CD40、TIGIT:NECTIN2,、CD74:COPA,、CD28:CD86、SIRPA:CD47 和 CD86:CTLA4）

TAM-T 細(xì)胞的 TIGIT-NECTIN2 相互作用與肝細(xì)胞癌的免疫抑制有關(guān)
CD44-SPP1 信號(hào)可以增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者抵抗力,，并且與巨噬細(xì)胞浸潤增加以及生存期較差有關(guān)

接下來,，作者研究了不同的基質(zhì)亞型如何與 TAM 和 CD8+ T 細(xì)胞相互作用。發(fā)現(xiàn)TIGIT-NECTIN2 信號(hào)在 CAFS1 亞型和 CD8+ T 細(xì)胞之間共享,，但 T 細(xì)胞配體-受體抑制信號(hào) (LGASL9-HAVCR2) 特定于 ecm-myCAF,。CAF-S1 和 TAM 相互作用由 CAF-S1 表達(dá)的 C3 和 CSF1 分子以及 TAM 受體 C3AR1、CXCR4 和 SIRPA 介導(dǎo),。值得注意的是,，MIF-CD74介導(dǎo) 的 CAF-TAM 相互作用增加了 CAF 中的 CD44 結(jié)合，導(dǎo)致 ERK1/2 激活,，從而促進(jìn)增殖并抑制細(xì)胞凋亡,。之前研究表明，在黑色素瘤中,，MIF-CD74的相互作用會(huì)導(dǎo)致髓源性抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制,。此外，作者發(fā)現(xiàn) ecm myCAFs 可以通過 TGFB1-TGFBR1/2 與 TAM 相互作用,，這已被證明促進(jìn)癌癥進(jìn)展,。