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4月16日,，百奧智匯創(chuàng)始人,、科學(xué)顧問張澤民教授在北京大學(xué)的課題組與合作者在國際頂級學(xué)術(shù)期刊《Cell》上發(fā)表了題為＂Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer＂的文章，利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對結(jié)直腸癌患者的腫瘤微環(huán)境，特別是浸潤髓系細胞類群首次進行了系統(tǒng)性的刻畫,，同時利用小鼠模型,，對anti-CSF1R抑制劑和anti-CD40激動劑兩種靶向髓系細胞的免疫治療策略潛在的作用機理給出了解釋。 該研究建立了結(jié)合腫瘤患者及小鼠模型的單細胞轉(zhuǎn)錄組來研究腫瘤免疫治療的范例,，為人們研究其他疾病中免疫細胞以及開發(fā)新的治療方案提供了思路,。 
圖1 課題總體設(shè)計與免疫治療作用機制 對于該研究，上海市免疫學(xué)研究所蘇冰所長,、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院葉幼瓊研究員等相關(guān)專家點評道：該工作全面地解析結(jié)腸癌的腫瘤微環(huán)境細胞圖譜,，闡明細胞與細胞之間的相互作用，對靶向腫瘤免疫微環(huán)境為基礎(chǔ)的腫瘤治療提供了更詳細的理論基礎(chǔ),，為今后靶定髓系細胞的精準治療提供助力,，具有重要的臨床轉(zhuǎn)化意義。 在該研究中,，研究者共使用了Smart-seq2,、10x 3′ Gene Expression、10x V(D)J + 5′ Gene Expression等3種單細胞測序技術(shù),，以及tSNE,、UMAP、PCA,、RNA velocity,、URD、PAGA,、STARTRAC,、GSVA富集分析、熱圖,、小提琴圖,、氣泡熱圖、軌跡圖,、Circos圖,、火山圖、生存分析等十多種生物信息學(xué)分析及展示方法,。值得一提的是,，這些實驗技術(shù)和分析方法，百奧智匯皆可實現(xiàn),。下面,，百奧小編就為大家詳細解析，帶大家了解這些技術(shù)和方法是如何在研究中應(yīng)用的,。1.10x Genomics和Smart-seq2技術(shù)比較圖2 實驗設(shè)計流程及兩種測序技術(shù)的結(jié)果比較該研究首先評估并比較了10x Genomics和Smart-seq2兩種單細胞測序技術(shù)的結(jié)果,。結(jié)果顯示,，與10x scRNA-seq平臺相比，Smart-seq2捕獲了更多的基因,，包括細胞因子,，CD分子，配體/受體和轉(zhuǎn)錄因子,，并且顯示出較弱的批次效應(yīng) ,，從而可以對調(diào)節(jié)途徑進行更深入的分析（圖2），而10x平臺則獲得了更多的分群,。因此,，作者將兩種技術(shù)同時使用，從而能夠最大化地確定細胞類型或稀有種群的數(shù)量,，改善細胞聚類的結(jié)果,，得出更準確的結(jié)論。2.tSNE降維——展示分群,、基因表達模式,、組織分布等多層信息圖3 18位CRC患者的所有免疫細胞和非免疫細胞的簇該研究使用無監(jiān)督聚類、PCA,、CGA等方法對來自18位CRC患者腫瘤,、鄰近組織和血液樣本的10× 3′ Gene Expression （ 43,817個細胞）和Smart-seq2（10,468）單細胞測序結(jié)果進行整合聚類分析，然后用tSNE進行降維展示,，分別得到38個和36個群,，包括6個內(nèi)皮細胞群，2個成纖維細胞群,，13個髓系細胞群,，4個ILC群，18個T細胞群和5個B細胞群等（圖3）,。圖4 特定免疫球蛋白基因在B細胞群中的不同表達模式對于淋巴細胞,，研究通過特異的的免疫球蛋白重鏈特征基因加以區(qū)分（圖4）。同時,，研究還在tSNE結(jié)果中展示了各細胞的組織分布情況（圖5）,。圖6 Smart-seq2測序非免疫細胞結(jié)果的tSNE分群展示對于Smart-seq2非免疫細胞的測序結(jié)果,，該研究利用tSNE將其分為12個亞群,，包括4個惡性細胞亞群和8個非惡性細胞亞群（圖6）。其中,，由推斷的拷貝數(shù)變異（CNV）定義的惡性細胞表現(xiàn)出高度的基因表達異質(zhì)性,，形成了患者特異性的分群（圖7）。3.熱圖,、氣泡熱圖——展示細胞間基因表達模式的差異
單個tSNE圖或組圖可展示單個或數(shù)個基因在不同細胞群中的表達情況,，但在展示多個樣本大量基因的全局表達情況時就相對吃力,。此時就需要用到熱圖。而氣泡熱圖則是在熱圖的基礎(chǔ)上加入了基因表達細胞在特定細胞群中占比的信息,，從而對細胞群進行更詳細的表征,。圖8 10x測序得到的髓系細胞和淋巴細胞群的基因表達熱圖圖9 10x和Smart-seq2測序得到的基因表達熱圖在該研究中，作者用熱圖展示了10x測序分析得到的38個白細胞群中的差異基因表達差異（圖8）,，以及整合10x和Smart-seq2測序分析得到的48個群的基因表達差異（圖9）,。研究還分析了13個髓系細胞中的特征基因表達情況（其中9個以氣泡熱圖展示），并據(jù)此將它們區(qū)分為肥大細胞（hM01）,，樹突狀細胞(hM02-04),，單核細胞(hM05-07，hM11),，組織駐留性巨噬細胞（hM08-10）和腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs,，hM12-13）。4.擴散圖,、RNA velocity,、URD、PAGA——推斷和展示細胞發(fā)育軌跡圖11 結(jié)合RNA velocity的擴散圖展示單核細胞的發(fā)育軌跡為進一步探索TAMs的來源,，該研究利用擴散圖中嵌入的RNA velocity對隨機選擇的單核細胞和巨噬細胞的發(fā)育軌跡進行推斷和展示,，鑒定出了從表達CD14的單核細胞向FCN1+ 單核樣細胞和不同的巨噬細胞群體的強烈定向流動（圖11），體現(xiàn)二者在發(fā)育上的前后順序,。圖12 基于URD的單核細胞擬時發(fā)育軌跡圖進一步利用URD和PAGA這兩種正交算法分析巨噬細胞的轉(zhuǎn)錄軌跡,，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞發(fā)育成TAMs（圖12，圖13）,。圖14 多種組織中單核細胞/巨噬細胞譜系的發(fā)育軌跡模型綜合上述軌跡推斷結(jié)果,，研究發(fā)現(xiàn)TAM主要來自獨特的腫瘤浸潤性單核樣細胞前體。其中,， C1QC+ 和 SPP1+ TAM都從浸潤腫瘤的單核細胞樣前體形成,，而 SPP1+ TAM也可能源自 NLRP3+ RTM（圖14）。5.火山圖,、富集分析,、熱圖、URD圖——多角度展示兩類TAMs差異對于兩類在發(fā)育軌跡上存在顯著差異的TAMs,，作者進一步使用熱圖,、火山圖、富集分析等方法進行了分析,，從多角度揭示了它們的差異,。圖15 熱圖展示兩類TAMs轉(zhuǎn)錄因子表達差異
由于細胞的發(fā)育軌跡受轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制，作者先分析了兩類TAMs轉(zhuǎn)錄因子的表達差異,，結(jié)果以熱圖顯示,。其中,，C1QC+ TAMs顯示出MAF/MAFB和FOS/JUNS高表達，而PP1+ TAMs則高表達CEBPB和ZEB2,。然后,，作者又用火山圖展示兩類TAMs中顯著差異表達的基因。該圖包含兩個維度,，其中縱軸P value體現(xiàn)顯著性,，橫軸fold change展示差異性。結(jié)果顯示,，C1QC+ TAMs顯示出補體C1Q,、TREM2、MERTK和CD80等基因的高表達,， 而SPP1+ TAMs顯示出SPP1,、MARCO和VEGFA的特異性表達。圖17 GSVE分析展示兩類TAMs在通路上的差異隨后,，作者又使用基因集合變異分析（GSVE）分析了兩類TAMs在通路上的差異,。GSVE是一種以非監(jiān)督方式對一個群體評估通路活性差異的基因集富集（GSE）分析方法。該研究的結(jié)果顯示,，SPP1+ TAMs顯示出腫瘤血管生成,，ECM受體相互作用、腫瘤脈管系統(tǒng),、大腸腺瘤和轉(zhuǎn)移性肝癌等通路的特異性富集,，而C1QC+ TAMs則顯示出補體激活以及抗原加工和呈遞途徑的富集（圖17）。圖18 URD圖展示TAMS血管生成和吞噬作用相關(guān)基因的表達此外,，SPP1 + TAMs還顯示了大腸腺瘤和轉(zhuǎn)移性肝癌通路的特異性富集和相關(guān)基因的表達（圖17和圖18）,，表明在它們CRC中有促癌/促轉(zhuǎn)移作用。6.相互作用網(wǎng)絡(luò)圖和Circos圖——展示細胞間相互作用,、受體配體相互作用圖19 基于單細胞測序和GTEx數(shù)據(jù)的細胞間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖圖20 基于單細胞測序和TCGA數(shù)據(jù)的細胞間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖更進一步地,，作者在CRC中建立了細胞間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。將該研究中的單細胞測序數(shù)據(jù)集與GTEx,、TCGA的組織整體RNA測序數(shù)據(jù)集進行整合分析,，發(fā)現(xiàn)TAM和cDC作為預(yù)測網(wǎng)絡(luò)的核心，與其他細胞類型的聯(lián)系最多（圖19,，圖20）,。其中，C1QC+ TAM和兩組cDC主要與其他免疫細胞（尤其是T細胞亞群）相互作用（圖20）,，提示其在抗腫瘤T細胞應(yīng)答中起調(diào)節(jié)作用,。圖20 Circos圖展示細胞群間的受體——配體相互作用再進一步的細胞群間的受體——配體相互作用分析顯示，在與髓系細胞和T細胞有關(guān)的配體-受體對中,，CXCL10-CXCR3在C1QC + TAM中富集,，暗示了C1QC+ TAM具有募集或激活T細胞的潛在作用。而SPP1+ TAMs中富集的SPP1-ITGAV,、SDC2-MMP2,、FN1-ITGA5等配體-受體對，則暗示了其在可能與某些整合蛋白相互作用,，以促進CRC的腫瘤發(fā)生,。圖21 將兩種對免疫治療敏感的小鼠模型用于單細胞測序分析圖22 相似性熱圖顯示出小鼠髓系細胞群與人的相似性為了將上述對人髓系細胞異質(zhì)性的研究發(fā)現(xiàn)與臨床應(yīng)用相結(jié)合,，作者接下來將相同的實驗和分析方法用于兩種對腫瘤免疫治療的小鼠模型中,，其中Renca對CSF1R阻斷抗體敏感，而MC38對CD40激動劑抗體敏感（圖21）,。作者使用10x Genomics平臺對免疫治療后小鼠的腫瘤中分離出的免疫細胞進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序,，并與人髓系細胞群進行了相似性分析，確定了多個跨物種相對應(yīng)的髓系種群,，包括兩種cDC群和兩種TAM群（圖22）,。圖23 熱圖顯示小鼠TAM的GSVA分析結(jié)果此外，對小鼠TAM群進行與人類TAM群相同的途徑分析發(fā)現(xiàn),，小鼠TAM群體也基于它們的血管生成,，低氧和T細胞相互作用基因特征而分離（圖23）。這些數(shù)據(jù)表明人類CRC患者和小鼠腫瘤模型之間存在功能相似的TAM群體,。8.細胞豐度,、生存分析——體現(xiàn)不同細胞類群的抗藥性圖24 抗CSF1R治療對不同小鼠TAM群體的影響圖25 柱狀圖顯示抗CSF1R治療后小鼠各類亞群的豐度進一步的耐藥性研究顯示，抗CSF1R治療后F4/80高表達的巨噬細胞優(yōu)先減少（圖24）,，說明不同的巨噬細胞群體對抗CSF1R治療的敏感性不同,。同時，治療后小鼠細胞群中mC12和mM14簇幾乎完全丟失,，TAM簇mM11,，mM13和mM15的減少最小（圖24）,，說明TAMs對CSF1R阻斷的治療具有抗性,。同時，抗CSF1R的TAM亞群優(yōu)先表達參與血管生成和免疫抑制的基因,，如Vegfa,，Cd274和Arg1。圖26 生存分析圖顯示不同TAMs基因特征CRC患者的預(yù)后情況為了將在小鼠中的發(fā)現(xiàn)與人類CRC相關(guān)聯(lián),，作者使用生存分析比較了具有不同水平C1QC+ TAM和SPP1+ TAM基因特征患者的生存率,，發(fā)現(xiàn)低C1QC+ TAM、高SPP1 +TAM組合與CRC患者的預(yù)后更差相關(guān)（圖26）,。這些發(fā)現(xiàn)表明,，抗CSF1R治療可能不足以耗盡所有具有促進腫瘤生長潛力的巨噬細胞,，這一特性可能是其單藥療效差的原因。
圖27 生存分析圖顯示不同DC激活程度CRC患者的預(yù)后情況類似的分析應(yīng)用于抗CD40治療則發(fā)現(xiàn),，抗CD40治療能夠激活cDC1細胞,，CCL22等激活的基因特征與CRC患者的總體生存期呈正相關(guān)（圖27），這可能部分解釋了抗CD40激動劑治療CRC的機制,。9.STARTRAC——分析T細胞的遷移,、克隆擴增和發(fā)育轉(zhuǎn)變
眾所周知，T細胞在腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要作用,。為進一步探索抗CD40激動劑治療CRC的機制,，作者基于TCRα和β鏈序列，應(yīng)用STARTRAC算法分析抗CD40治療后T細胞的遷移,、克隆擴增和發(fā)育轉(zhuǎn)變,，以了解抗CD40激動劑治療對腫瘤浸潤性T細胞功能的影響。圖29 抗CD40激動劑治療對T細胞克隆擴增的影響結(jié)果顯示,，抗CD40激動劑治療后,，Ccl5+ Tem CD8+ T細胞具有比其他CD8+ T細胞亞群更高的遷移指數(shù)（圖28）。進一步剖析Ccl5+ Tem亞群內(nèi)的TCR克隆型表明,，克隆擴增較高的細胞在腫瘤和腫瘤引流淋巴結(jié)之間表現(xiàn)出更多的TCR共享,，表明這些細胞在抗CD40處理后具有更強的遷移能力（圖29）。圖30 抗CD40激動劑治療對T細胞發(fā)育轉(zhuǎn)變的影響同時,，Ccl5+ Tem和Cxcr6+ Trm CD8+ T細胞之間的過渡指數(shù)在基線時顯著高于CD8+ T細胞亞群中其他對的過渡指數(shù),，表明某些Cxcr6+ 腫瘤中的Trm細胞可能在某一過程中由浸潤的Ccl5+ Tem細胞發(fā)育轉(zhuǎn)變而來，這一過程在抗CD40治療后得到了進一步增強（圖30）,。這些數(shù)據(jù)表明,，抗CD40治療對腫瘤浸潤性T細胞的擴增，遷移和發(fā)育轉(zhuǎn)變具有獨特影響,，能夠加強Ccl5+ Tem的遷移和克隆擴增能力,，及其向Cxcr6+ Trm CD8+ T細胞轉(zhuǎn)變的能力。10.相關(guān)性分析——揭示細胞間存在相互作用圖31 Th1類細胞與cDC1細胞的相關(guān)性分析
在研究中作者發(fā)現(xiàn),，Th1類細胞與成熟和未成熟的cDC1細胞均顯示正相關(guān),，表明這兩類細胞之間存在相互作用。在此基礎(chǔ)上,，結(jié)合該研究中發(fā)現(xiàn)的Bhlhe40 + Th1類細胞在抗CD40治療后的占比以及特異性擴增,、Bhlhe40 + CD4 + T細胞能夠產(chǎn)生更多IFNγ，以及之前研究發(fā)現(xiàn)的表達IFNG的BHLHE40 + Th1樣細胞富集于MSI CRC患者人群中且顯示出對ICB治療的良好反應(yīng)等結(jié)果,，作者認為抗CD40治療導(dǎo)致增加的Bhlhe40 + Th1樣細胞可能為在該模型中CD40激動劑治療能夠成功與抗PD1協(xié)同的機制提供了解釋,。先通過單細胞轉(zhuǎn)錄組、免疫組測序等技術(shù),，對CRC患者的腫瘤微環(huán)境進行細胞分群,、基因差異表達、細胞發(fā)育軌跡,、細胞間相互作用等多水平,、多維度的詳細表征,，發(fā)現(xiàn)了腫瘤浸潤髓系細胞類群中兩類特殊的細胞類群TAM和cDC可能在CRC的抗腫瘤T細胞應(yīng)答,、腫瘤發(fā)生等過程起調(diào)節(jié)作用。然后利用小鼠模型,，將上述發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于對anti-CSF1R抑制劑和anti-CD40激動劑兩種靶向髓系細胞的免疫治療策略的潛在作用機理的解釋中,。
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