撰文：huacishu

IF=41.583

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1,、作者繪制了人類腺瘤和鋸齒狀息肉的單細胞分辨率圖譜；

2,、作者證明鋸齒狀息肉源于化生,，而不是干細胞擴張；

3,、作者證明鋸齒狀息肉的細胞毒性免疫獨立于超突變,；

4、作者證明不同的免疫微環(huán)境可以跟蹤腫瘤細胞分化狀態(tài),。

范德堡大學Ken S. Lau博士課題組在國際知名期刊Cell在線發(fā)表題為“Differential pre-malignant programs and microenvironment chart distinct paths to malignancy in human colorectal polyps”的論文,。結直腸癌（CRC）起源于結直腸息肉，其細胞起源,、分子異質性和免疫原性可能在高分辨率分析時揭示診斷和治療見解,。文章展示了兩種最常見的人類結直腸息肉的單細胞轉錄組學和成像圖譜，即常規(guī)腺瘤和鋸齒狀息肉,。對62名參與者的128個數據集進行綜合分析后發(fā)現,，腺瘤起源于WNT驅動的干細胞擴增，而鋸齒狀息肉則來源于通過胃化生分化的細胞,?；嚓P損傷與超突變前的細胞毒性免疫微環(huán)境相耦合，部分原因是與腫瘤細胞分化狀態(tài)相關的抗原呈遞差異,。作者的的多組學圖譜提供了大腸息肉惡性進展及其微環(huán)境的見解,，作為精確監(jiān)測和預防結直腸癌的方法,。

采用單細胞RNA測序（scRNA-seq）、多重免疫熒光（MxIF）和多重免疫組織化學（MxIHC）進行研究,。發(fā)現（DIS）集包括65個分析標本,，包括30個腫瘤。驗證（VAL）集包括63個分析樣本,，包括32個腫瘤（圖1A）,。總的來說,，在62個腫瘤上生成了128個獨立的scRNA序列數據集。標本來自不同性別,、種族和年齡組,。此外，分別對66個和281個息肉進行了大量RNA序列和靶向基因測序,。在組織學上將息肉分為兩個亞型：由管狀ADs（TAs）和管狀類ADs（TVAs）組成的ADs,，或由增生性息肉（HPs）和SSL組成的鋸齒狀息肉（SER）（圖1B）。通過進行全外顯子組測序（WES）和體細胞突變調用（圖1C）,，對ADs和SER的突變譜進行了表征,。由于息肉體積小，單細胞分析優(yōu)先考慮新鮮組織,，使用福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）材料進行WES,。在85%的TA和兩種TVA中檢測到APC突變。只有一個（8%）TA有KRAS突變,，而兩個TVAs都有,。除了一個SSL（89%）外，所有SSL都有致癌BRAF^V600E突變,；三個GCHPs中沒有一個攜帶BRAF突變,，但有兩個（67%）MVHPs攜帶BRAF突變，這與MVHPs是進化中的SSL一致,。在SSLs中未檢測到APC和KRAS突變,，并且所有ADs均未檢測到BRAF突變。令人驚訝的是,，沒有一個SSL表現出超突變表型,，而一部分TA/TVA表現出超突變表型。由于啟動子甲基化,，MSI-H CRC中的MLH1表達通常丟失,，而SSLs中的MLH1蛋白和基因表達與ADs相當，兩者均高于MSI-H CRC的平均水平,。在任何息肉中均未檢測到錯配修復基因的雙等位基因缺失,，進一步證明這些SSL尚未獲得超突變表型,。

由于轉錄因子（TF）定義的調控子活動被認為是細胞身份的決定因素，因此使用SIVENT（單細胞調控網絡推斷和聚類）,，這是一種基于調控子的提取工具,，用于調整息肉特異性效應。將DIS數據集中的上皮細胞聚集,，以正?；顧z數據集為參考標志，顯示了七個正常,、規(guī)范的上皮細胞群（圖2A和2B）,。息肉標本也含有大量與其組織病理學一致的正常細胞（圖1B、2B）,。然而,，兩個細胞群體在息肉樣本中占絕大多數，這是由比例聚類代表性的逐樣本細分確定的（圖2B和2C）,。一個群體富含TA和TVA,，以下稱為ASCs（AD特異性細胞）。第二個腫瘤群體富含SSL和HPs,，以下稱為SSC（鋸齒狀特異性細胞）,。重要的是，這些結果以及下面的其他結果在DIS和VAL數據集中是一致的（圖2A-2C）,，證明了其精確性和再現性,。ASC類似于結腸干細胞和祖細胞，表達WNT通路激活的基因（LGR5,、OLFM4,、ASCL2、AXIN2,、RNF43和EPHB2）（圖2A）,，并且具有比來自相同個體的正常干細胞更大的干細胞特征（圖2D）。由于ASC與正常干細胞相似,，使用細胞追蹤來推斷其干細胞潛能,。正常干細胞具有較高的細胞追蹤分數，并轉化為分數較低的分化細胞（圖2E）,，形成了干細胞,、轉化細胞和分化細胞之間相對一致的分數分布。相比之下,，ASCs的細胞追蹤分析得出的分布偏向具有高預測干細胞潛能的細胞（圖2E）,。利用TF靶點相似性創(chuàng)建了一個共同的TF調節(jié)網絡，描述了基因作為程序和途徑的協(xié)調調節(jié)。一些協(xié)調的調控子簇,，稱之為超級調控子,，在ASC和SSC中的比例過高，包括以MYC,、ASCL2,、TCF7和TEAD1活性為標志的WNT-和Hippo-驅動的超級調控子（圖2F），與這些程序在腸干細胞再生和更新中的作用一致,。對于支持損傷誘導化生過程作用的SSC,，觀察到一個超級調節(jié)子，指示白細胞介素信號和微生物群相互作用（圖2G）,。在另外58個ADs（36個TA,，22個TVA）和8個SSL上，用批量RNA序列驗證了分類息肉亞型的基因特征,。這些結果證實了作者的發(fā)現：在ADs中,，WNT激活了干細胞擴增程序，在SSLs中,，WNT激活了胃化生程序。

由于SSC可能來源于分化細胞的化生,，作者假設SER來源于腫瘤發(fā)生的“自上而下”模型中的分化細胞,，而ADs來源于“自下而上”方式的增殖性干細胞。為了提供腫瘤起源的組織學證據,，通過多重成像繪制了腫瘤細胞的位置,。干細胞標記OLFM4和SOX9在ADs中大量存在，但在HPs和SSL中顯著減少（圖3A和3B）,。在正常結腸和ADs中檢測到核CDX2,，但在HPs中減少，在SSLs中缺失（圖3C）,。SSC標記物MUC5AC在HPs和SSL中高表達,，但在正常活檢和ADs中不表達（圖3D）,。細胞追蹤評分和WNT靶基因重疊確定了干細胞分支,，與ASC共享，表明異常擴增的干細胞是ADs的起源（圖3E）,。與此形成鮮明對比的是,，推測SSC是由吸收祖細胞和結腸細胞發(fā)育而來。對單個腫瘤的RNA速度分析基本上證實了這些發(fā)現（圖3F）,。在正常標本中,，速度載體起源于干細胞，并流入分化的細胞類型。ASC被認為是由干細胞發(fā)育而來的,，但SSC的速度向量是相反的,，這表明這些細胞的起源是非干細胞。

惡性CRC細胞的scRNA-seq數據顯示了實質性的腫瘤間變異性（圖4A）,。結合癌前數據,，隨著上皮細胞從正常細胞向癌前細胞轉化為惡性細胞，觀察到腫瘤間異質性增加,。通過使用來自ADs和SERs的預先鑒定的基因集,，觀察到MSS和MSI-H CRC細胞都保留其各自前體的部分。比較兩種亞型,，MSS CRC細胞過度表達再生干細胞的特征,，MSI-H CRC細胞保留化生特征（圖4B和4C）。為了進一步支持癌癥前期和癌癥之間的共性,，按照分子亞型（CMS）對ASC,、SSC和CRC細胞進行分類（圖4D）。ASCs和MSS CRC細胞對CMS2評分較高,，CMS2是最常與WNT通路失調相關的亞型,。相反，SSC和MSI-H CRC細胞在CMS2中得分較低,，但在CMS1和CMS3中得分較高,，這兩種細胞分別具有免疫原性和RAS通路激活。作者還研究了從癌前病變向惡性腫瘤轉變過程中獲得或丟失的特征,。與SSC相比,，MSI-H CRC細胞顯示出相對減少的化生特征。然而,，與干細胞內的關鍵基因相比,，WNT-SSC被激活。細胞追蹤分析表明MSI-H CRC細胞比SSC具有更高的干細胞潛能,，而MSS CRC細胞的得分也高于ASC（圖4E）,。基因調控網絡分析更清楚地證明了在惡性轉化過程中分子途徑是如何維持或改變的,，這一點得到了GSEA的支持（圖4F-4I）,。與息肉相比，兩種CRC亞型都激活了它們的增殖超級調節(jié)子,，并豐富了DNA合成和修復程序（圖4F-4I）,。WNT信號超級調節(jié)子在ASC和MSS CRC細胞中持續(xù)上調（圖4F和4G）。對于MSI-H CRC細胞,，描述SSC中病原體損傷反應的超級調節(jié)子被抑制,，但先前在SERs中被抑制的WNT信號超級調節(jié)子被激活（圖4H和4I）。這些結果表明MSI-H CRC通過轉化為更具攻擊性的干細胞樣細胞而獲得非化生的功能。

作者進一步查詢了來自TCGA的63個批量RNA序列數據集,，并驗證了CMS亞型與化生性特征之間的關聯(lián),。然而，在單個腫瘤的基礎上,，這些數據比scRNA-seq數據更具噪聲性,，可能是由于數據質量差和額外的腫瘤內異質性造成的。引人注目的是,，沒有一個MSS CRC（0/17）對MUC5AC呈陽性,，但大多數MSIH CRC（13/14）呈陽性（圖5A和5B）。然而,，在陽性的MSI-H CRC中,，MUC5AC染色的腫瘤面積是可變的。CDX2染色呈相反趨勢,；實際上,，MSS CRC中的所有腫瘤細胞均為CDX2陽性，MSI-H CRC的CDX2染色有不同程度的減少,。干細胞標記物（OLFM4,，SOX9）在整個MSS CRC中表達，并且它們一致缺乏MUC5AC表達（圖5C和5D）,。相反,，MSI-H CRC顯示出相當大的腫瘤內MUC5AC異質性，在MSI-H CRC的某些區(qū)域染色較低,；這些區(qū)域對OLFM4和某種程度的CDX2呈陽性（圖5E-5H）。對單個scRNA序列數據集的集中分析驗證了這些結果,。MUC5AC和MSLN陽性表達,，再加上CDX2表達缺失，使同一腫瘤內的化生細胞與LGR5/b-連環(huán)蛋白表達的增殖性干細胞區(qū)分開來（圖5I,、4C和4E）,。

由于SERs未顯示超突變，而MSIH CRC顯示超突變,，作者試圖確定SERs在早期是否具有獨特的腫瘤微環(huán)境,。結合對來自癌前病變和CRC的非上皮性scRNA-seq數據的分析，并根據標記基因表達及其在腫瘤亞型之間的組成變化確定不同的細胞類型（圖6A和6B）,。與正常組織相比,，大多數免疫細胞類型在息肉中增加，包括CD4 T細胞,，盡管許多在息肉亞型之間沒有差異（圖6C）,。AD衍生的與正常結腸CD4 T細胞相比，FOXP3調節(jié)子活性更高，這與一定程度的Treg依賴性免疫抑制一致（圖6D）,。ASC表達吸引單核細胞的趨化因子信號,，而SSC表達吸引淋巴細胞的細胞因子信號，這對建立適應性免疫環(huán)境很重要（圖6E）,。與ASC相比,，SSC中的抗原處理和呈遞基因特征顯著更高，MSI-H CRC細胞中的抗原處理和呈遞基因特征也比MSS CRC細胞高（圖6E）,。這些數據表明,，從癌前到癌癥，一些適應性免疫調節(jié)機制的持續(xù)存在似乎與超突變無關,。多重成像顯示,，與ADs相比，SERs具有更高數量的T細胞,、CD8 T細胞和更高比例的CD8 與CD4 T細胞（圖6F和6G）,，而其他免疫細胞群沒有顯著差異。骨髓樣細胞的豐度在scRNA-seq和成像上沒有差異,，但CD68 巨噬細胞分布在整個AD基質中,，而它們集中在SERs的管腔表面，與MUC5AC 化生細胞的表面位置一致（圖6H）,。在MUC5AC 化生區(qū)CD8 T細胞顯著富集,，在OLFM4 區(qū)CD8 T細胞數量減少（圖6I）。相比之下,，MSS CRC在整個腫瘤中的T細胞較少,，它們均勻地由OLFM4 干細胞樣細胞組成（圖6I）。這些結果加強了SERs的化生起源與細胞毒性免疫微環(huán)境之間的聯(lián)系,。

為了確定鋸齒狀腫瘤發(fā)生中的細胞毒性反應是否是超突變前腫瘤細胞狀態(tài)的固有因素,，使用了模擬早期腫瘤發(fā)生事件的基因工程小鼠。Lrig1^CreERT2/ ,；Apc^2lox14/ 是AD通路的模型,，導致遠端結腸腺瘤性腫瘤。驅動Braf激活突變不會導致肉眼可見的腫瘤,，但會導致近端結腸絨毛狀化生（圖7A）,。與對照正常結腸相比，Apc突變腫瘤的b-連環(huán)蛋白染色升高,，CD8 T細胞數量減少,，這與人類ADs和MSS CRC一致。相比之下,，Braf突變病變與CD8 T細胞浸潤增加相關,，明顯的是,，僅在分化細胞室中，而在突變隱窩中沒有（圖7B和7C）,。使用免疫染色和轉錄組學,，確定Mist1 細胞代表結腸隱窩基底外的一個細胞子集。重要的是,，Mist1 細胞通過Apc的雙等位基因重組（Mist1^CreERT2/ ,；Apc^{2lox14/2lox14}）引發(fā)結腸腫瘤（簡稱Mist1腫瘤），隨后發(fā)生2.5%的DSS損傷,，代表了一種非干細胞驅動的腫瘤模型,。每只小鼠近端結腸與遠端結腸的Mist1腫瘤發(fā)生率為7:1（圖7D和7E），這與Lrig1^CreERT2/ 中腫瘤的遠端結腸優(yōu)勢不同,。為了解釋這兩種腫瘤類型的分子結構,，對腫瘤組織和對照結腸進行了scRNA-seq，并鑒定了腫瘤特異性細胞,，包括異常的Paneth細胞（圖7F-7H）,。由于一種常見的WNT驅動的突變過程，來自兩種腫瘤類型的腫瘤特異性細胞（TSC）形成了一個Lgr5過度表達的細胞群,，而沒有化生基因特征（圖7G-7I）,。此外，兩種腫瘤類型的b-連環(huán)蛋白染色均升高,，反映WNT被激活（圖7E）,。雖然腫瘤類型之間的突變過程相同，但作者發(fā)現免疫微環(huán)境存在顯著差異,。Mist1腫瘤與SERs類似,，含有較高比例的CD8 T細胞（圖7J-7M）。這些細胞表達活性細胞毒性和殺傷效應物的標記物（圖7N）,。Lrig1腫瘤具有明顯的功能失調的CD4 T細胞群（圖7J-7M）,。這些細胞表達免疫抑制標記物，如Pdcd1（PD1）,、Ctla4、Prdm1和Havcr2（TIM3）,，以及Foxp3調節(jié)子基因,，表明功能失調的T細胞具有調節(jié)特性（圖7N）。多重成像顯示,，與Lrig1腫瘤相比,，Mist1腫瘤中浸潤CD8 T細胞的腫瘤數量顯著增加，但CD4 T細胞的數量不明顯（圖7O和7P）,。為了將上皮干細胞與微環(huán)境差異聯(lián)系起來,，應用細胞追蹤顯示Lrig1 TSC具有顯著更高的推斷干細胞潛能,，并且比Mist1 TSC表達更多的干細胞和分化程度更低的細胞基因（圖7Q）。反過來,，Lrig1腫瘤細胞在形成類器官方面明顯比MIST 1腫瘤細胞更成功（圖7R）,。從先前定義與免疫細胞相互作用相關的正常腸道干細胞的干細胞梯度（ISCI>ISCI>ISCII）的工作中，發(fā)現Lrig1 TSC表現出較高的ISCI分數,，而Mist1 TSC表現出較高的ISCI和ISCII分數（圖7S）,。與ISCII和ISCII增加的抗原呈遞能力一致，Mist1 TSC也增加了抗原呈遞機制的表達（圖7T和7U）,。Mist1類腫瘤細胞比Lrig1類腫瘤細胞處理和表達更多的抗原,，這通過DQ-OVA的內吞作用和蛋白水解以及I-A/I-E染色反映，表明表面抗原表達（圖7V）,。為了支持這一觀察,，與Lrig1類腫瘤相比，Mist1類腫瘤在呈現OVA肽時刺激T細胞增殖的能力增強（圖7W）,；與正常遠端結腸相比,，在Lrig1類腫瘤中觀察到這種作用受到抑制。與ADs相比,，人類類腫瘤分析顯示人類SERs中的干細胞容量降低,，同時抗原呈遞基因特征增加（圖6E）。

本研究作者提出了一個多組學人類癌前圖譜,，該圖譜整合了單細胞轉錄組學,、基因組學和免疫組織病理學，描述了兩種最常見的結直腸癌途徑,。確定并在功能上驗證了建立不同腫瘤景觀的不同起源和分子過程,。值得注意的是，只有通過對CRC原始病變的觀察,，才能更清楚地了解晚期和高度異質性癌癥,，從而為精確預防、監(jiān)測和治療的新策略鋪平道路,。

教授介紹

Ken S. Lau博士就職于范德堡大學,，實驗室的中心目標是了解炎癥微環(huán)境，是如何向上皮細胞發(fā)出信號以改變其表型的,。微環(huán)境信號被精確調節(jié),，以限制和維持上皮細胞、管腔微生物和潛在免疫細胞之間的穩(wěn)態(tài),。平衡失調會導致炎癥性腸病和結直腸癌等疾病,。Ken S. Lau博士利用單細胞方法，如解剖細胞因子（Simmons et al.,，2015）,、多重成像（MxIF）（McKinley et al.,，2017）和單細胞RNA序列來查詢單細胞狀態(tài)。Ken S. Lau博士的目標是在體內揭示上皮細胞群體（如癌癥干細胞）的異質性和可塑性程度,，并將這些知識轉化為治療上可處理的靶點,。

參考文獻

Chen B, Scurrah CR, McKinley ET, et al. Differential pre-malignant programsand microenvironment chart distinct paths to malignancy in human colorectalpolyps. Cell. 2021;S0092-8674(21)01381-7. doi:10.1016/j.cell.2021.11.031

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