圖1 研究流程圖

1. 建立銅死亡-缺氧亞型

利用無監(jiān)督聚類，根據(jù)與銅死亡和缺氧相關的關鍵基因,，將TCGA_CADREAD患者分為三個群,，即CHS1、CHS2和CHS3,。CHS1 在銅死亡方面得分最高,，在缺氧方面得分最低，而 CHS3 則相反,。驗證數(shù)據(jù)集的得分特征與訓練集一致,。CHS1 的分期較早，轉移較少,，而 CHS3 則呈相反趨勢,。不過，三個亞型在年齡和性別方面沒有明顯差異,。

2. 突變特征

單核苷酸多態(tài)性（SNP）特征在 CHS 的前 10 個基因中呈現(xiàn)出差異（圖A),。基因突變率差異很大,，即使在它們之間共有的基因中也是如此,。例如，在 54% 的 CHS1 中發(fā)現(xiàn)公認的癌基因 Kras 發(fā)生突變,，而在 CHS3 中僅發(fā)現(xiàn) 3%,。CRC 細胞中的 Kras 突變通過改變細胞內銅池來改變對銅生物利用率的需求?？紤]到CHSs之間的銅死亡差異,，Kras狀態(tài)可能與CRC的銅死亡有關。作為 CRC 的一個不利預后因素,，Braf 突變率在 CHS1 和 CHS3 中分別為 3.7% 和 17.3%,，表明 CHS3 的預后較差（圖2）,。在驗證集中，Kras 和 Braf 在 CHSs 中的突變傾向得到了驗證（圖2）,。不同亞型的 SNP 類型比例也有所不同,。

圖2 CHS 的基因組特征

拷貝數(shù)變異（CNV）分析表明，不同 CHS 的異常擴增和缺失情況各不相同（圖 2）,。突變率結果 q < 0.05 的位點被保留用于 GO 富集分析,。CHS1 中的基因座富集了循環(huán)免疫球蛋白、適應性免疫反應等,。CHS2 的結果包括 mRNA 剪接和細胞對 INF_a 的反應,，而 CHS3 的結果則包括脂質代謝和內源性細胞凋亡等（圖3）。

3. 富集分析

作者根據(jù)特征標記30進行了GSVA,，以描述CHS的特征,。令人驚訝的是，幾乎所有亞型之間的基因集都存在顯著差異（圖3A）,。CHS3的細胞增殖、侵襲和轉移,、避免免疫破壞和誘導血管生成的能力更強,，而CHS1的細胞逃避生長抑制和能量代謝失調的能力更強。在三個驗證集中也觀察到了相同的趨勢,。作者基于GO基因集進行了GSVA,，以進一步分析多種一般生物學特征。如圖所示圖3B,，3B,，在增殖、血管生成,、侵襲,、干性和免疫方面存在差異，所有這些在CHS1和CHS3之間更為明顯,。

圖3 CHS的代表性生物學特征

為了探索CHS1和CHS3之間的差異,，作者首先進行了差異分析以識別DEG，在此基礎上進行了GO分析,。結果顯示,，DEGs主要富集在轉移和免疫相關途徑中（圖3C）。此外,，作者觀察到具有經(jīng)典生物學特征的代表性途徑的GSEA在CHS3中更活躍（圖3D）,，也驗證了GSVA的結果（圖3B）。在三個驗證隊列中,，所有上述結果都呈現(xiàn)出與訓練集相同的趨勢,。

一致分子亞型（CMS）可能是CRC最可靠的分類,。它將患者分為4類，即具有高突變和免疫激活的CMS1,；具有顯著WNT和MYC信號激活的CMS2,；CMS3，明顯的代謝失調,；和CMS4具有顯著的TGF-β活化,、基質細胞侵襲性血管生成和不良預后。如圖所示圖3E,，3E,，CHS1主要對應于CMS2和CMS3，CHS2沒有傾向性分布,，CHS3主要屬于CMS4,，這與CHS的標志性特征和預后特征一致。兩個分類法的對應關系在驗證隊列中是相同的,。

4. CHS的代謝概況

由于細胞代謝與銅死亡和缺氧有關,，以及能量代謝在標志性分析中的意義，作者基于所有KEGG代謝途徑進行了GSVA,，以探索CHS的代謝譜,。這表明，除聚糖外,，CHS1中其他物質的代謝最為活躍,。值得注意的是，與銅死亡密切相關的TCA循環(huán)和硫辛酸代謝在CHS1中更為活躍（圖3F,，3G）,，這對應于它們與銅死亡之間的生理關系。由于氧化磷酸化是TCA循環(huán)后有氧呼吸的關鍵步驟,，作者還對氧化磷酸化進行了GSEA,。結果表明，CHS1和CHS3的氧化磷酸化程度沒有顯著差異（p=0.705）,。這與Tsvetkov等人的研究結果一致,，表明銅對銅死亡的影響是通過TCA循環(huán)而不是直接靶向電子傳輸鏈。三個驗證數(shù)據(jù)集的代謝分析結果與訓練組的結果相似,。

5. CHS的免疫景觀

免疫系統(tǒng)充當重要的抗腫瘤屏障,。CHS3中T細胞庫（TCR）和B細胞庫（BCR）的豐度和多樣性較高，表明CHS3中有更多的T細胞和B細胞浸潤,。TIMER的結果顯示,，CHS中的六個主要免疫細胞亞型差異顯著，并且在CHS3中最豐富（圖4A）,。EPIC的結果與TIMER基本一致,。值得注意的是,，CSH3中癌癥相關成纖維細胞（CAFs）的比例也高得多（圖4B），與特征標記和CMS結果一致,。MCP計數(shù)器的結果也符合TIMER和EPIC,。

圖4  CHS的免疫狀況

接下來，作者使用估計算法來評估TME的總體狀態(tài)（圖4C）,。從ESTIMATE獲得的三個指標在CSH3中最高,，表明CHS3中的免疫細胞和基質成分相對更豐富。CHS3的腫瘤純度最低,，與估計得分呈陰性,。驗證隊列的得分呈現(xiàn)出相同的趨勢。作者測量了免疫檢查點阻斷（ICB）相關分子的表達,，并觀察到它們在CHS3中的表達最高（圖4D）,。高淋巴細胞分數(shù)也與ICB的更好療效有關。分析表明,，CHS3中的淋巴細胞分數(shù)也是最高的,。ICB的效能直接受到TME41的影響。Fowler等人建立了Fges（功能性基因表達特征）,，將TME分為四種不同的亞型,。分析表明，F(xiàn)ges在三種亞型中的特征是不同的（圖4E）,。

6. 在單細胞水平上檢查亞型的特征

在注釋了細胞類型后，作者從單細胞數(shù)據(jù)集中獲得了2212個腫瘤細胞（圖5A）,。一些關鍵基因的表達顯示出明顯的差異,。例如，銅死亡調節(jié)因子ATP7B和SLC31A1幾乎只在腫瘤細胞中表達,。相反,，一些基因如SLC2A3和RORA在除腫瘤細胞外的其他細胞中高度表達。

圖5 單細胞和有核梭桿菌分析

作者的分類器將腫瘤細胞分為三亞型,，以觀察生物學特征并驗證大量轉錄組數(shù)據(jù)的結論,。也就是說，CHS1中的TCA循環(huán)和硫辛酸代謝比CHS3更活躍,。CHS3細胞的其他代表性特征比CHS1細胞更強（圖5C-E）,。

7. CHS人群DNA甲基化模式及微生物群特征

異常甲基化與腫瘤發(fā)生、細胞凋亡和治療耐藥性有關,。CHS1和CHS3之間甲基化位點的比較顯示了不同的甲基化位點,。免疫和脂質代謝是基于差異位點的十大富集分析途徑之一，從另一個維度驗證了轉錄組分析結果的可靠性,。

微生物群在CRC的起源,、發(fā)展和治療反應中的重要性已被逐漸認識到,，尤其是有核梭桿菌（F.n）。CHS3中的F.n豐度顯著較高（圖5F）,。TIGIT和BIRC3是與F.n相互作用的關鍵因素,，可抑制CRC中的腫瘤免疫并促進化療耐藥性。LBP,、MD2,、TLR4和CD14負責一般細菌作用50。對上述基因的分析表明,，它們在CHS3中的表達顯著更高,，與F.n的豐富性一致（圖5G）?；趯毦磻幕蚣腉SEA顯示,，每條途徑的p值都小于0.05（圖5H）。這表明組織中的F.n可能改變多種信號通路的轉導,，從而影響CRC的腫瘤發(fā)生和進展,。

8. 競爭性內源性RNA（ceRNA）網(wǎng)絡的構建

Salmena等人提出了ceRNA的概念來描述不同類型ncRNA之間復雜的調控關系。最近發(fā)現(xiàn),，它們在各種疾病中都是不可忽視的,，包括CRC 。作者對miRNA進行了差異分析,，獲得了150個差異表達的miRNA,。富集分析表明，差異miRNA在JNK級聯(lián)和干擾素-γ結合中富集,?；趍iRNA和lncRNA的差異，作者使用StarBase獲得了10個中樞l(wèi)ncRNA和28個中樞miRNA,。接下來,，作者利用miRNA-mRNA預測網(wǎng)站獲得409個靶向mRNA，并成功地用細胞鏡可視化了ceNetwork,。

9. 泛癌分析

鑒于銅死亡和缺氧都是非癌癥特異性的,，作者探討了上述分類法是否適用于其他癌癥。使用TCGA-COADREAD作為訓練集,，應用KNN對癌癥進行分類,。大多數(shù)腫瘤具有與CRC相同的評分特征——銅死亡評分在CHS1中最高，在CHS3中最低,，而缺氧評分則相反（圖6A）,。

圖6 泛癌細胞中CHS的經(jīng)典生物學特征

10. 泛癌細胞特征圖譜

由于CRC的特征在CHS之間存在顯著差異，作者對特征進行了GSVA,，以調查泛癌細胞的CHS是否具有相同的生物學特征,。在幾乎所有的癌癥中,，CHS3表現(xiàn)出更活躍的細胞增殖、轉移,、免疫破壞和血管生成,，而CHS1具有更強的逃避生長抑制和能量代謝失調的能力（圖6B）。此外,，作者在泛癌細胞中進行了各種特定途徑的GSVA,。大多數(shù)癌癥與CRC相同，CHS在增殖,、干性,、侵襲性、血管生成和免疫方面存在顯著差異,。上述差異在CHS1和CHS3之間更為明顯,。GSEA的結果與GSVA一致，即上述特征在CHS3中更為活躍（圖7A）,。

圖7 泛癌3例CHS的免疫景觀

11. 泛癌細胞的代謝特征

基于KEGG代謝途徑的泛癌GSVA的代謝特征表明,，大多數(shù)腫瘤的代謝特征與CRC的代謝特征具有相同的趨勢——除了聚糖生物合成外，物質代謝在CHS1中最活躍（圖6C）,。病理類型為腺癌的癌癥的特征與結直腸癌具有更高的相似性,，突出了組織來源和病理類型的重要性。TCA循環(huán)的活性和脂肪酸代謝呈現(xiàn)出相似的趨勢,。這些結果表明CHS分類是腫瘤代謝的一個重要方面,，尤其是腺癌。

12. 泛癌CHS的免疫景觀

TIMER,、EPIC和MCP-計數(shù)器用于評估全癌免疫細胞的浸潤,。作者發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)患有TIMER的癌癥類型中,，6種免疫細胞的CHS之間存在顯著差異,，趨勢與CRC相同（圖7B）,。通過EPIC和MCP-計數(shù)器獲得的結果也與CRC的結果相同,。TCR和BCR的豐度和多樣性顯示出相同的趨勢。根據(jù)估計評估,，大多數(shù)癌癥中免疫細胞和基質成分的浸潤與CRC中每種亞型的浸潤相似,。與CRC一樣，ICB相關分子在CHS中的表達最高,，但在CHS1中最低,。然后，作者根據(jù)Fges將泛癌TME分為四種亞型,，并與CHS進行比較,，其對應性與CRC一致,。也就是說，大多數(shù)CHS1屬于D亞型,，CHS3屬于IE/F或F亞型,，這證實了CHS3中TME的高度纖維化（圖7C）。

13. 聚類在臨床應用中的探索

經(jīng)典藥物的敏感性和類器官驗證為了評估CHSs的藥物敏感性,，作者從Drugbank檢索了CRC藥物的靶分子,，并分析了它們在CHSs中的特異性表達。作者觀察到CHS中化療藥物和靶向藥物的多個靶點表達存在明顯差異（圖8A）,。靶向分子在CHS3中的較高表達表明該亞型可能從藥物中受益更多,。

圖8 聚類的臨床應用

利用轉錄組學數(shù)據(jù)將類器官樣本成功分類為CHS。類器官的IC50值與DrugBank的預測一致,。CHS3對氟和SN38（體內伊立替康的活性形式）最敏感,，而CHS1相對不敏感（圖8B）。根據(jù)臨床療效,，CSH3患者確實從化療中獲益更多（圖8C）,。對GSE28702的分析還表明，CHS3對FOLFOX的反應率最高,?？傊@些結果表明,，這種分類法在指導臨床用藥方面是有價值的,。

14. 新藥預測與細胞驗證

使用cMap數(shù)據(jù)庫，作者確定了五種針對CHS1和CHS3的強效藥物,，并分析了這些藥物與關鍵基因之間的相關性,。為了測試療效，作者用藥物治療了屬于不同CHS的CRC細胞系,，但馬索前列醇除外,。作者選擇LS180、HT29和HCT116,、SW620細胞分別代表CHS1和CHS3,。CHS1和CHS3細胞之間代表性關鍵基因的表達在轉錄水平和蛋白質水平上是不同的。IC50結果顯示,，除毛喉素,、帕唑帕尼和MK-0752外，大多數(shù)藥物對CRC細胞具有較強的細胞殺傷作用（圖S18）,。在其余藥物中,，大多數(shù)細胞系的IC50與預測趨勢一致——對CHS3敏感的藥物在HCT116和SW620中的IC50值較低，而對CHS1敏感的藥物則呈現(xiàn)相反的趨勢（圖8D）。transwell測定顯示,，大多數(shù)藥物對兩種細胞亞型的遷移具有有效和不同的影響（圖8E,，F(xiàn)）。對CHS3敏感的藥物在更大程度上削弱了HCT116和SW620的遷移能力,。菌落形成呈現(xiàn)出類似的趨勢（圖8G,、H）。一般來說,，馬西替尼對CHS1細胞的增殖,、遷移和存活具有更明顯的影響，這表明馬西替尼可能對CHS1具有意想不到的抗腫瘤作用,。類似地,，對CHS3應用辛伐他汀。

15. 聚類的預測價值

訓練集的生存分析表明,，CHS的結果有顯著差異,。CHS1的預后最好，而CHS3的預后最差（圖8I）,。在驗證集中觀察到相同的生存趨勢（圖8J）,。這也與Braf突變的指示一致（圖2B）。

作者根據(jù)CHS1和CHS3之間的預后差異構建了一個預后模型,。得分較高的患者預后較差,。此外，作者用該模型建立了一個列線圖,，用于臨床應用,。1年、3年和5年的時間依賴ROC曲線的曲線下面積分別為0.8,、0.8和0.81,。最后，作者構建了校準曲線,，以測試預測生存概率和實際信息的一致性,。ROC和校準曲線都驗證了該模型的良好預測性能。

總結

總之,，作者根據(jù)銅死亡和缺氧對CRC進行了多組學分析,，將患者分為三種特征明確的亞型。分型算法適用于泛癌,，每個CHS的一般生物學過程和免疫特征在泛癌患者中相似,。對于CRC,，化療和靶向治療對CHS3更有效,，改善缺氧可能會進一步促進這些作用。對于大多數(shù)泛癌病例,，在抗纖維化和抗缺氧條件下,，CHS3可能從ICB治療中受益匪淺,。