編譯：思越,，編輯：景行、江舜堯,。

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原名：Lineage-dependent gene expression programs influence the immune landscape of colorectal cancer

譯名：細胞譜系依賴性基因表達程序?qū)Y(jié)直腸癌中免疫景觀的影響

期刊：Nature Genetics

IF：27.603

發(fā)表時間：2020年6月

通訊作者：Sabine Tejpar & Woong-Yang Park

通訊作者單位：成均館大學三星健康科學與技術(shù)高級研究所 & 比利時魯汶大學

DOI號：10.1038/s41588-020-0636-z

1   結(jié)直腸癌中全局細胞景觀

為了闡明結(jié)直腸癌中細胞類型,，在本研究共分析了三星醫(yī)學中心(SMC)的23名韓國CRC患者,、以及魯汶大學(KUL3)的6名比利時CRC患者的91103個CRC單細胞(圖1a)。進行RCA和CCA聚類分析后,，使用marker基因?qū)λ袉渭毎M行注釋,，在SMC和KUL3中注釋了6中主要的細胞類型(圖1b-c)：上皮細胞、成纖維細胞/內(nèi)皮細胞,、髓系細胞,、T/NK/NK T淋巴細胞、B淋巴細胞/漿細胞,、肥大細胞,。

根據(jù)腫瘤組織的分子亞型以及遺傳和臨床信息，對每個CRC患者的細胞類型進行分類(圖1b-c),。與正常組織相比,，在腫瘤組織中觀察到髓系細胞總體增加、B細胞數(shù)量總體減少,，提示免疫應(yīng)答被重定向,，表明了在癌癥發(fā)展過程中免疫反應(yīng)經(jīng)歷動態(tài)變化的過程。在SMC中,，發(fā)現(xiàn)CMS亞組之間的細胞比例存在差異,，與CMS1和CMS4腫瘤相比，CMS2和CMS3腫瘤的免疫和基質(zhì)細胞比例降低(圖1b),，并通過bulk RNA-seq表明CMS2和CMS3腫瘤中免疫細胞含量降低(圖1d),，與之前報道的CMS2 CMS3屬于免疫冷亞型一致。

圖1. RCA和CCA聯(lián)合應(yīng)用識別結(jié)直腸癌中細胞類型A.樣本收集和單細胞轉(zhuǎn)錄組分析的工作流程B.SMC和C.KUL3中的t-SNE圖(左上),，CRC組織和正常黏膜中細胞類型占比(左下,、右圖)D.使用ESTIMATE算法計算23個bulk RNA-seq的基質(zhì)得分，免疫得分和腫瘤純度,。

2   單細胞CMS特征

先前研究發(fā)現(xiàn),，人類結(jié)腸癌細胞也具有正常結(jié)腸上皮細胞的多系分化過程。SMC數(shù)據(jù)集中,，對正常上皮細胞進行亞型分析顯示其存在不同的分化狀態(tài),，包括干細胞樣/運輸擴增細胞、結(jié)直腸細胞,、杯狀細胞(圖2a),，KUL3數(shù)據(jù)集也表現(xiàn)出類似的分化多樣性，并通過跡分析表明分化起源于干細胞樣/運輸擴增細胞,，并向結(jié)腸細胞或者杯狀細胞分支,。腫瘤細胞的分化軌跡與正常上皮細胞的分化軌跡類似,，具有正常干細胞樣/轉(zhuǎn)運擴增細胞群的腫瘤細胞聚集(圖2b)，說明腫瘤上皮細胞具有再生和增殖潛力,。

為了針對性探究腫瘤細胞的轉(zhuǎn)錄程序,，研究者將腫瘤上皮細胞進行聚類分析，結(jié)果顯示,，許多腫瘤細胞形成了病人特異的簇,，這表明與正常細胞相比腫瘤上皮細胞在每個患者中具有高度可變的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。為了消除腫瘤上皮細胞的個體差異,，找到共同的轉(zhuǎn)錄組特征,，使用Monocle v.2的反向圖形嵌入技術(shù)重建了一個無監(jiān)督腫瘤細胞的軌跡。軌跡揭示了一個轉(zhuǎn)錄層次結(jié)構(gòu),，定義了9種分子狀態(tài),，并匯聚成兩個離散的轉(zhuǎn)錄組集(圖2c)。一類高富集轉(zhuǎn)運和Wnt信號基因的表達(FABP1,，ID1,，ID3，OLFM4和ASCL2),，另一類為分泌和遷移基因的表達(TFF1,，TFF2，TFF3,，SPINK4和AGR2)。這些轉(zhuǎn)錄特征映了結(jié)直腸癌中的CMS(圖2d),，在單細胞中CMS2 CMS3的樣本被投影到了腫瘤上皮細胞的分化軌跡中,，而BUKL測序數(shù)據(jù)中為CMS1 CMS4(圖2c)，提示腫瘤上皮細胞對CMS2 CMS3亞型的貢獻較大,，而成纖維細胞和免疫細胞對CMS1 CMS4的貢獻較大,。

通過計算每個樣本中CMS樣的單細胞比例，發(fā)現(xiàn)患者主要以CMS2樣細胞主導以及由CMS1樣和CMS3樣細胞主導(圖2d),。CMS1樣和CMS3樣細胞共表達不同水平的CMS1免疫基因和CMS3分泌上皮特征基因,，提示兩個亞群之間存在密切關(guān)系。CMS1樣腫瘤細胞在大部分的CMS1組織中占主導地位,，提示腫瘤或非腫瘤成分驅(qū)動的兩種不同的免疫細胞激活模式,。此外，單細胞CMS模式與解剖區(qū)域,、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)和腫瘤突變譜有關(guān)(圖2e),，CMS2樣細胞主導的樣本與TP53和APC共突變有關(guān)，CMS1樣和CMS3樣主導的樣本與KRAS和BRAF基因突變相關(guān),。但是,，發(fā)現(xiàn)很少有CMS4樣腫瘤細胞,，即使是來自CMS4組織(圖2c)。在分析細胞類型對各組織分子亞群的影響時,，發(fā)現(xiàn)上皮腫瘤細胞與CMS4基因呈負相關(guān),，基質(zhì)細胞(包括成纖維細胞和內(nèi)皮細胞)正相關(guān)最高(圖2f)，并與轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)相關(guān),。此外,，CMS中個別患者的腫瘤細胞表現(xiàn)出不同的瘤內(nèi)異質(zhì)性，以及增殖,、干細胞特性,、缺氧和化療耐藥等與癌癥相關(guān)的信號?？傊?，本研究分析表明，由于腫瘤微環(huán)境與腫瘤內(nèi)異質(zhì)性引起的轉(zhuǎn)錄活動調(diào)節(jié)等譜系相關(guān)致癌事件呈現(xiàn)出功能多樣化和環(huán)境適應(yīng)的現(xiàn)象,。

3   基質(zhì)細胞動力學支持腫瘤生長

在基質(zhì)細胞亞群中，成纖維細胞和內(nèi)皮細胞是主要的細胞類型,。另外,，周皮細胞、血管平滑肌細胞和腸膠質(zhì)細胞被確定為次要的基質(zhì)細胞類型(圖3a),。周細胞的特征是收縮基因(TAGLN,、ACTA2)和RGS5共表達；血管平滑肌細胞的特征是收縮和細胞骨架基因表達基因表達(TAGLN,、ACTA2,、MYH11、SYNPO2,、CNN1和DES),；腸膠質(zhì)細胞的的特征是SOX10， S100B和PLP1基因表達(圖3b),。

成纖維細胞亞群通過COL3A1,、DCN和THY1的表達來定義，在正常粘膜中,，間質(zhì)成纖維細胞的類型分別為S1,， S2和S3。S2成纖維細胞位于上皮單層附近，表達BMP和Wnt通路基因以支持上皮祖細胞的增殖和功能,。而在癌癥組織中,，主要為肌成纖維細胞(圖3b)。肌成纖維細胞在CMS1和CMS4組織中最顯著(圖3a,，c),，說明不同亞型中基因表達是異質(zhì)的(圖3b，d),。根據(jù)差異表達基因可細分為MF1-4組,。MF1富集于細胞外基質(zhì)合成，MF2富集于細胞外基質(zhì)降解和炎癥趨化因子,，MF3的RGS5提示起源于周細胞,， MF4用于具有mf2類特性的增殖。所有肌成纖維細胞簇均高表達Wnt信號基因,，如POSTN和WNT5A(圖3b),。這些結(jié)果表明，肌成纖維細胞通過廣泛的組織重塑刺激腫瘤生長,，并通過Wnt信號支持癌癥干細胞存活,。

內(nèi)皮細胞簇以ENG和PECAM1基因表達為特征，并且無成纖維細胞特征(圖3a,，b),。研究者將八個內(nèi)皮細胞簇分為四種內(nèi)皮細胞類型，包括尖端細胞和柄細胞,。在腫瘤和正常樣本中都發(fā)現(xiàn)了其中一個亞群：淋巴管內(nèi)皮細胞(類17,，圖3a-b)。血管內(nèi)皮細胞簇包括尖狀和柄狀內(nèi)皮細胞,，其中大多是腫瘤(類6,，8)或正常結(jié)腸來源的(類9，14,，15)。值得注意的是,，比較正常和腫瘤組織之間的尖端和柄細胞類型,，發(fā)現(xiàn)腫瘤中“血管生成調(diào)節(jié)因子”過多，而在正常粘膜中“抗原處理和呈遞因子”過多(圖3e),。此外,，還發(fā)現(xiàn)一個高增殖細胞群，,，表現(xiàn)為過表達生存素(BIRC5)和CKS1B,，作為單獨的腫瘤來源集群。之前的研究認為這些基因與內(nèi)皮細胞凋亡抑制和增殖相關(guān),。在結(jié)腸癌中,，內(nèi)皮細胞的高血管生成特性反映了新生血管的激活,，抗原呈遞血管內(nèi)皮細胞數(shù)量不足提示免疫刺激減弱(圖3e)，ICAM1基因表達的下調(diào)也支持CRC中內(nèi)皮成分的免疫衰減,。

圖3. 正常黏膜和CRC組織中的基質(zhì)細胞動力學,。A.SMC數(shù)據(jù)集的基質(zhì)細胞的t-SNE圖，腫瘤組織和正常黏膜中細胞數(shù)量和亞細胞類型比例B.成纖維細胞和內(nèi)皮細胞的譜系標記基因熱圖C.不同CMS類下成纖維細胞亞群比例及平均細胞數(shù)D.肌成纖維細胞上每個簇的前5個DEGE.內(nèi)皮細胞的分層聚類熱圖,。

4   從粘膜免疫向抑制細胞免疫的轉(zhuǎn)變

在CRC組織中,，髓系擴張表明其在塑造腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮積極作用。通過亞聚類分析將髓細胞分為巨噬細胞和樹突狀細胞(圖4a-b),。巨噬細胞簇包括促炎和抗炎亞群(圖4a-c),，樹突狀細胞簇為傳統(tǒng)樹突狀細胞，高度表達CD1C和FCER1A.與KUL3患者相比,，SMC患者的正常粘膜中發(fā)現(xiàn)了極少的髓細胞,，并在兩個數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)了相似的髓細胞類型(圖4a-b)。

腫瘤組織中的巨噬細胞呈混合表型,，表達促炎和抗炎基因(圖4c),。特別的是，滲出型焦磷酸蛋白1(SPP1⁺⁾巨噬細胞在腫瘤核心和邊緣富集,。脂多糖,，一氧化氮，γ干擾素和白介素-1β等促炎分子可誘導SPP1基因表達,，產(chǎn)生骨橋蛋白,。SPP1⁺巨噬細胞還表達與抗炎表型有關(guān)的載脂蛋白E (APOE)，說明SPP1⁺巨噬細胞的顯著擴張可能通過骨橋蛋白在免疫抑制和腫瘤進展中發(fā)揮核心作用,。此外,，SPP1⁺巨噬細胞在CMS1型和CMS4型患者中增加(圖4c)，并通過TCGA的COAD和READ隊列驗證(圖4d),。此外,，SPP1⁺表達水平高的患者預(yù)后較差(圖4d)，這反映了擴張的SPP1+巨噬細胞集群在CRC中的臨床影響,。

在正常黏膜和CRC組織中,，T淋巴細胞是最大的免疫細胞群,。SMC數(shù)據(jù)集中的20個T細胞亞群代表來自CD4⁺，CD8⁺,，γδT細胞和NK細胞的不同的T細胞亞群(圖5a),。CD4⁺和CD8⁺T細胞簇都包含幾個亞簇，代表從初始狀態(tài)到激活或衰竭狀態(tài)的過渡。研究者分別標記了來自其他CD4⁺ T細胞簇的調(diào)節(jié)性(Treg)和T輔助性17 (Th17)亞群,。發(fā)現(xiàn)T細胞亞型在正常組織和腫瘤組織中分布不均：Th17和Treg細胞主要分布于腫瘤組織,，正常粘膜中γδT細胞較為豐富(圖5a-b)。當評估與MSI狀態(tài)相關(guān)的免疫細胞組成作為免疫檢查點抑制劑陽性反應(yīng)的替代標志物時,，發(fā)現(xiàn)在SMC數(shù)據(jù)中,，MSI-H樣本在高Treg人群和低Th17人群中富集(圖5b，c),。還通過對細胞毒性和衰竭進行評分來評估CD8⁺T細胞亞群的功能狀態(tài),，腫瘤組織中CD8⁺T細胞的細胞毒性和耗竭評分高于正常粘膜中的評分(圖5d)。

在SMC數(shù)據(jù)集的B細胞簇中,，發(fā)現(xiàn)了卵泡B細胞和漿細胞,，并在CRC組織中，發(fā)現(xiàn)卵泡B/漿細胞顯著減少以及不同抗體同型表達(圖5e),，且大多數(shù)輕鏈特異性漿細胞中,，IGHA的表達減少和IGHG的表達增加，提示免疫微環(huán)境發(fā)生了系統(tǒng)性變化,。在KUL3數(shù)據(jù)集中,，在腫瘤的核心和邊緣觀察到IGHA漿細胞的整體收縮，但在腫瘤核心的IGHG基因表達轉(zhuǎn)移更為明顯,。

5   CMS特異性細胞互作網(wǎng)絡(luò)

為了對細胞動力學的改變進行統(tǒng)計學評估，對25種細胞亞型的正常組織相對腫瘤組織在CMS分組,、 MSI-H分組,、解剖位置進行卡方檢驗(圖6a)，發(fā)現(xiàn)肌成纖維細胞,，巨噬細胞,，CD8⁺ T細胞，Treg細胞,，Th17細胞和免疫球蛋白G(IgG⁺)漿細胞在腫瘤組織中富集,，而基質(zhì)成纖維細胞、CD4⁺ T細胞,、γδ T 細胞和IgA+漿細胞在正常黏膜中富集。CRC細胞景觀在不同的CMS,、MSI-H狀態(tài)和解剖區(qū)域下不同,，在CMS1腫瘤中，包括大多數(shù)MSI-H樣本，Treg細胞顯著富集,，而肌成纖維細胞和促炎/SPP1⁺巨噬細胞在CMS4腫瘤中最為顯著,。

為了了解不同細胞群之間的相互作用，以及它們?nèi)绾喂餐M成結(jié)直腸腫瘤微環(huán)境,，基于受體配體數(shù)據(jù)庫(receptor–ligand)推斷出了一個假定的細胞相互作用網(wǎng)絡(luò),。在正常黏膜中，IgA⁺漿細胞和CD4⁺ T細胞周圍形成相互作用最強的節(jié)點,，表明粘膜抗體反應(yīng)的激活,。CRC組織中的IgA網(wǎng)絡(luò)減少，但腫瘤細胞周圍出現(xiàn)了新的相互作用邊,，連接到肌成纖維細胞,、SPP1⁺巨噬細胞、CD8⁺ T細胞和Treg細胞,。此外,，我們在不同CMS組織亞型下分析CRC細胞網(wǎng)絡(luò)，以適應(yīng)腫瘤微環(huán)境的總體差異,。在CMS1和CMS4中,，前20個預(yù)測的相互作用主要涉及非腫瘤細胞類型，如CMS1的Treg細胞或肌成纖維細胞和CMS4腫瘤的SPP1⁺巨噬細胞,。CMS2和CMS3組織中,，前20個預(yù)測的相互作用發(fā)生在腫瘤和非腫瘤細胞類型之間，說明腫瘤細胞在塑造腫瘤微環(huán)境中的主導作用,。

在特異性受體-配體對的分子重構(gòu)中,，估計了CMS4腫瘤中顯著的SPP1-CD44和TGFB1-TGFBR相互作用(圖6b)，這些分子相互作用在免疫抑制和促進轉(zhuǎn)移的腫瘤微環(huán)境中至關(guān)重要,?？傊?/span>全面的細胞景觀和相互作用網(wǎng)絡(luò)揭示了CRC的分子特征,，譜系相關(guān)的遺傳改變以及基質(zhì)和免疫中腫瘤驅(qū)動的改變(圖6c),。

圖6. CRC中不同CMS分類下分子互作網(wǎng)絡(luò)的差異重編程。A.腫瘤與正常組織之間的細胞動力學變化,，并根據(jù)CMS亞型,、MSI狀態(tài)和解剖位置對腫瘤分組比較 B.使用CellPhoneDB推斷每個樣品的受體-配體相互作用 C.CRC中由于微環(huán)境因素導致的腫瘤發(fā)生和信號放大作用引起的遺傳改變示意圖。

有關(guān)CRC的單細胞轉(zhuǎn)錄組研究,，發(fā)現(xiàn)的特定細胞類型十分有限,。本工作分析了來自23個韓國人和6個比利時人的91103個未分類的單細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對樣本進行共識分子亞型(CMS)分類,，分析總樣本以及各自分類中細胞的關(guān)系,，研究了樣本的分化途徑和轉(zhuǎn)錄程序,，同時發(fā)現(xiàn)單細胞CMS模式與解剖區(qū)域、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)和腫瘤突變譜相關(guān),。基質(zhì)細胞動力學研究發(fā)現(xiàn),，肌成纖維細胞通過廣泛的組織重塑刺激腫瘤生長。隨后分析了正常黏膜和CRC組織中免疫細胞的分布差異,。最后重建了細胞間互作網(wǎng)絡(luò),，研究了癌細胞特征和特定基質(zhì)或免疫細胞群之間的聯(lián)系。該工作中對結(jié)直腸癌細胞景觀和細胞間相互作用的觀點為設(shè)計有效的免疫腫瘤治療策略提供了機制信息,。

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