經(jīng)常有QC的朋友會(huì)遇到檢驗(yàn)結(jié)果距離預(yù)期有較大差距的情況,，或者批間差距（波動(dòng)）比較大的情況,，自己也搞不清楚是怎么回事，沒(méi)準(zhǔn)還挨老板（領(lǐng)導(dǎo)）訓(xùn),，“你怎么搞的”,、“你做沒(méi)做過(guò)回收率呀”、“回收率都沒(méi)有問(wèn)題,，檢驗(yàn)怎么就出問(wèn)題了,！”等等。有時(shí)固然是你檢驗(yàn)的問(wèn)題,，有時(shí)可能是我準(zhǔn)備在第十四章寫(xiě)的檢驗(yàn)參數(shù)的問(wèn)題,，還有種可能就是回收率在“騙你”。

為什么說(shuō)回收率會(huì)“騙你”,，這是因?yàn)槭紫仁悄阆取膀_了”它,，如果你“騙了”它，那么它偶爾“騙你”一兩次也不過(guò)分吧,。而一旦它“騙了”你,，那你以后的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)可能就都是騙你和你的老板了。

大家都聽(tīng)說(shuō)過(guò)質(zhì)量源于設(shè)計(jì)的說(shuō)法了,，也有人聽(tīng)說(shuō)過(guò)DOE（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)）的說(shuō)法,，可能有些人根本就沒(méi)有意識(shí)到自己在“騙”回收率，得到到個(gè)“好”的結(jié)果就覺(jué)得萬(wàn)事大吉,，殊不知如果你在設(shè)計(jì)上有缺陷,，那你得到的結(jié)果可能就將會(huì)是一個(gè)“假陽(yáng)性”。這一點(diǎn)包括CDE也不一定審得出來(lái),，曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)過(guò)ANDA方法驗(yàn)證回收率中有DOE缺陷,，CDER也一樣沒(méi)發(fā)現(xiàn)，但這都不能說(shuō)明什么,，關(guān)鍵在于你的回收率是做給誰(shuí)的,，如果是做給你自己的，你覺(jué)得今后“受騙”的將是誰(shuí)。

每次開(kāi)頭都說(shuō)那么多,，閑話少說(shuō),。下面我將舉幾個(gè)例子來(lái)說(shuō)說(shuō)看，看看大家自己是不是在DOE上存在類似的情況,。

1,、制劑含量測(cè)定

1.1加樣回收的必要性

很多人認(rèn)為加樣回收是中藥用的東西，西藥比較簡(jiǎn)單,，沒(méi)有必要做加樣回收,，直接回收就好了；還有人認(rèn)為,，我們API溶解性好,，沒(méi)有必要做加樣回收，做起來(lái)還特別麻煩,。

但制劑技術(shù)就是這么牛,，它可以把難溶性API變得相對(duì)好溶解，也可以把易溶的API搞得溶解性變差,，如果你考慮不到這一點(diǎn),，你就把API和輔料直接投到容量瓶里,，甚至把API先溶解了再加到容量瓶里,，測(cè)得的回收率當(dāng)然就沒(méi)有問(wèn)題，但你怎么保證你的片子在測(cè)定時(shí)也像你的API那么好溶,。

我曾經(jīng)遇到過(guò)一個(gè)產(chǎn)品,，API在水中是易溶的，在醇中也有很好的溶解性,，但檢測(cè)發(fā)現(xiàn)溶出度比含量（采用含量均勻度平均值,，相當(dāng)于投片法）高很多，有的批次甚至高10%以上,，而且都是HPLC檢測(cè)的,、色譜條件也是一樣的。進(jìn)一步調(diào)查發(fā)現(xiàn),，該產(chǎn)品含量/穩(wěn)定性含量波動(dòng)非常大,，而溶出度卻相對(duì)比較穩(wěn)定性，尤其是穩(wěn)定性,，有時(shí)含量已經(jīng)“下降了”差不多10%,，而溶出度卻沒(méi)有任何變化。你說(shuō)我該相信哪個(gè),？有人說(shuō)當(dāng)然要相信含量了,，溶出度是個(gè)半定量的方法。但此時(shí)和更多的時(shí)候，我選擇了相信溶出度的結(jié)果：因?yàn)槿艹龆纫彩欠€(wěn)定性指示的方法,，在樣品能夠全部溶解的情況下,，影響溶出度準(zhǔn)確度和精度的主要就是量筒，它的誤差要大于量瓶,，但影響不會(huì)超過(guò)2%,；而溶出度原液的濃度一般要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于含量測(cè)定的貯備液的濃度，也就是說(shuō)其相對(duì)濃度會(huì)低于含量測(cè)定貯備液,，即可能有更好的溶解性,。因此我做了一個(gè)簡(jiǎn)單的試驗(yàn)：取幾批樣品在不同時(shí)間進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，分別按正常方法制備供試品溶液（先制貯備液再稀釋）和直接加大溶劑體積直接配制成供試液的濃度,，分別測(cè)定含量,，再與溶出度結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,，按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的含量測(cè)定結(jié)果批間差異比較大,，但基本上都低于溶出度；而直接稀釋法測(cè)定的含量結(jié)果與溶出度測(cè)定結(jié)果出奇的一致,，且波動(dòng)性較小,。

這就說(shuō)明了一個(gè)道理，制劑在含量測(cè)定樣品貯備溶液制備中濃度相對(duì)較高（其實(shí)絕對(duì)并不高,，80μg/ml,，且溶劑中易溶），其中的主成分不能被全部溶解釋放出來(lái),；而此時(shí)如果是API加輔料的話則可能很容易溶解釋放出來(lái),，這一點(diǎn)對(duì)于含有大量黏合劑的緩釋制劑中尤其可能，而對(duì)于一些特殊劑型例如包埋類的產(chǎn)品,，則可能性更是存在,。這樣如果你采用直接加入法測(cè)定的回收率看起來(lái)可能非常不錯(cuò)，但是它是在騙你的,。所以此時(shí)就顯示出的結(jié)果可能就是回收率很好,，但產(chǎn)品的質(zhì)量比預(yù)期要低，而且波動(dòng)性可能還很大,。

這時(shí)就顯示出加樣回收率的優(yōu)勢(shì)了：例如一個(gè)產(chǎn)品理論含量為100%,，測(cè)得的含量為90%，那么意味著回收率為90%,，而你采用API加輔料測(cè)定回收率時(shí)回收率為100%,，而如果你采用的是一半制劑一半API加輔料的加樣回收的方法的理論回收率為（90% 100%）/2＝95%，如果上下各有1%的誤差的話,，前者回收率的范圍是99%～101%,，后者的范圍是94%～96%，那么即使你回收率的可接受標(biāo)準(zhǔn)是每個(gè)樣品均在97.0%～103.0%，你也會(huì)發(fā)現(xiàn)其不符合要求,，檢驗(yàn)方法有問(wèn)題,。

1.2研磨吸附的影響

其實(shí)我遇到過(guò)更多的情況是這樣的，很多品種的含量均勻度平均值與溶出度的結(jié)果是一致的,，波動(dòng)性也很?。欢繙y(cè)定的結(jié)果卻明顯低于上述兩項(xiàng),，而且往往色譜條件也是一致的,。與上面的結(jié)論是一樣的，最終的調(diào)查結(jié)果是含量測(cè)定的結(jié)果有問(wèn)題,，含量均勻度與溶出度的檢驗(yàn)結(jié)果更可信,。這在小規(guī)格制劑品種是非常常見(jiàn)的。有一次我在給一家企業(yè)的研發(fā)部門講檢驗(yàn)技術(shù)方面的課時(shí),，甚至遇到了中間體含量千奇百怪的數(shù)據(jù),，從80%多到100%，什么樣的數(shù)都有,，制劑人員根本就不敢壓片,，我就告訴他們，你們直接按照理論片重壓就好了（直接壓片工藝）,，不用管檢驗(yàn)數(shù)據(jù),，結(jié)果無(wú)論是含量還是含量均勻度都與預(yù)期是一致的。

QC相對(duì)于制劑中間產(chǎn)品的檢驗(yàn)來(lái)說(shuō),，更重要的是一種確認(rèn),；如果你用QC的檢驗(yàn)結(jié)果作為指導(dǎo)制劑生產(chǎn)（例如折算片重）,，往往可能會(huì)造成災(zāi)難性的后果,。不管QC人愛(ài)不愛(ài)聽(tīng)，之前我也不愛(ài)聽(tīng)過(guò),，但這也是我血的教訓(xùn)得出的結(jié)論,。事實(shí)上也是，發(fā)現(xiàn)OOS后調(diào)查的結(jié)果,，原因是由于檢驗(yàn)造成的可能不低于80%,，剩下可能在10%是取樣的問(wèn)題，不到10%才是生產(chǎn)的問(wèn)題,。當(dāng)然我會(huì)推文中去解釋這是為什么,、以及怎么去解決。

看到本節(jié)的小標(biāo)題,，大家可能也猜到了原因,，就是吸附！

我們國(guó)內(nèi)受藥典影響，很多研發(fā)人員在檢驗(yàn)方法開(kāi)發(fā)時(shí)都習(xí)慣于采用研磨的方法,，而有很多產(chǎn)品,，尤其是小規(guī)格產(chǎn)品，在研磨的過(guò)程中主成分易被研磨工具所吸附,，進(jìn)而造成你稱取那部分的樣品主成分的含量相對(duì)較低,，致使最終產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果偏低，而一旦這樣的結(jié)果用于指導(dǎo)壓片/填充,，可能你的含量均勻度或溶出度的結(jié)果就不一定高成什么樣子了,。當(dāng)然由于吸附的不可控性，你的含量結(jié)果也有可能有很大波動(dòng),，或者接近于預(yù)期值或者遠(yuǎn)離預(yù)期值,。

在這種情況下，為什么回收率是怎么“騙”我們的呢,？道理很簡(jiǎn)單,，你的API是直接加入到容量瓶里去的，這個(gè)過(guò)程是沒(méi)有研磨工具去吸附你的API的,，所以你可能得到很好的數(shù)據(jù),！換句話說(shuō)，你的檢測(cè)是有研磨過(guò)程,，而你的回收率驗(yàn)證是沒(méi)有這個(gè)過(guò)程的,，也就是說(shuō)，你的驗(yàn)證與你的方法是不一致的,！你回收率驗(yàn)證的操作應(yīng)該是,，分別取相當(dāng)于20片量的API和輔料，置研缽中,，研細(xì)（時(shí)間,、力度應(yīng)與檢驗(yàn)一致），再稱取規(guī)定重量的樣品,，去配制溶液,，再去檢測(cè)回收率。

還有一點(diǎn)需要說(shuō)明的是,，做回收率不同樣品應(yīng)分別研制,，而不要從一個(gè)研磨中稱取，以避免恰好該研磨過(guò)程吸附極少而帶來(lái)的“假陽(yáng)性”數(shù)據(jù),。必要時(shí)應(yīng)考慮不同人員之間的差異,。

2、有關(guān)物質(zhì)檢驗(yàn)

其實(shí)本部分內(nèi)容在本論壇中已經(jīng)有過(guò)闡述,，還是那個(gè)要求,，你的驗(yàn)證應(yīng)與你檢驗(yàn)方法一致,。例如對(duì)于特定雜質(zhì)，你的檢驗(yàn)方法是校正因子的方法,，而你在回收率驗(yàn)證時(shí)采用的是外標(biāo)法計(jì)算回收率,，此時(shí)的數(shù)據(jù)就是一個(gè)偽數(shù)據(jù)，因?yàn)槟汶s質(zhì)的計(jì)算方法是不同的,，在回收率計(jì)算時(shí)沒(méi)有采用校正因子,。這也是我當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)ANDA方法驗(yàn)證中存在的缺陷，但“所幸”的是CDER沒(méi)有發(fā)現(xiàn),。

3,、微生物限度檢驗(yàn)

3.1純化水中的微生物

很多人在論壇中問(wèn)，純化水微生物限度檢驗(yàn)要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證嗎,。

其實(shí)道理很簡(jiǎn)單,，你首先要清楚微生物檢驗(yàn)方法驗(yàn)證驗(yàn)證的是什么，不外就是通過(guò)回收率來(lái)確認(rèn)你的樣品本身對(duì)菌是否有抑制作用,，如果有的話方法就不適用,，如果沒(méi)有的話方法就適用。

那么水本身沒(méi)有抑菌性是公認(rèn)的,，你還需要驗(yàn)證嗎,？

其次，如果水本身有抑菌性的話,，那你的培養(yǎng)基中含有95%以上的水,，也就是說(shuō)你一個(gè)培養(yǎng)皿里15ml培養(yǎng)基其中有約13ml的水，而你純化水檢驗(yàn)時(shí)采用的薄膜過(guò)濾法所殘留的水也就0.1ml,，你13ml的水都不去關(guān)心,，你卻去關(guān)心那0.1ml的水？?jī)蓚€(gè)皿之間培養(yǎng)基水的量之間差得也不止0.1ml吧,！

第三,，也就是最關(guān)鍵的一個(gè)。你如果要做回收率驗(yàn)證,，那么你采用什么菌種,，還是藥典中那五種嗎,？例如中國(guó)藥典現(xiàn)行版檢測(cè)的培養(yǎng)基是富營(yíng)養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,，這五種菌在該培養(yǎng)基中均適于生長(zhǎng)，你用這五種菌測(cè)得的回收率數(shù)據(jù)當(dāng)然會(huì)非常漂亮,，除非你的DOE有問(wèn)題,，但它能代表實(shí)際嗎？簡(jiǎn)單的一個(gè)實(shí)驗(yàn)就會(huì)得出結(jié)論,，用一組純化水,，分別采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂和R2A培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè),，可能最終的結(jié)果是，用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基檢測(cè)的結(jié)果幾乎都是<1CFU/ml,，而用R2A培養(yǎng)基檢測(cè)的結(jié)果可能甚至達(dá)到幾十CFU/ml,！那么此時(shí)你的回收率呢，是不是在“騙你”,！與其進(jìn)行回收率試驗(yàn),，不如進(jìn)行培養(yǎng)基篩選。由于水的來(lái)源不同,，有些菌適合于低營(yíng)養(yǎng)下成長(zhǎng),，而有些適于富營(yíng)養(yǎng)下成長(zhǎng)。由于水本身營(yíng)養(yǎng)成分比較低,，除非是受污染的水作為原水,，所以一般更適用于在低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基下成長(zhǎng)，相信這也就是為什么中國(guó)藥典計(jì)劃修改純化水檢測(cè)用培養(yǎng)基的原因,。

3.2表面微生物

那么設(shè)備表面的微生物的檢驗(yàn)方法需要進(jìn)行驗(yàn)證嗎,？

實(shí)際上道理都是一樣的?？赡芪覀兏P(guān)心取樣方法本身帶來(lái)的影響,，但實(shí)際上這種影響相對(duì)于微生物的檢驗(yàn)誤差是幾乎可以忽略的，要知道微生物檢驗(yàn)方法甚至在回收率50%～200%都是可以接受的（見(jiàn)USP）,。

還有一個(gè)重要的原因,，就是你設(shè)備表面微生物（例如清潔驗(yàn)證）是要求在設(shè)備干燥條件下進(jìn)行的，而如果你去進(jìn)行驗(yàn)證,，那在你涂到設(shè)備表面上到表面完全干燥,，這個(gè)過(guò)程可能有些菌已經(jīng)死去了，這就可能造成驗(yàn)證結(jié)果的“假陰性”,。

總之,，要想你的回收率試驗(yàn)結(jié)果不“騙”你，你就要設(shè)計(jì)好你的檢驗(yàn)方法和驗(yàn)證操作,，并確保二者在操作方法上是一致的,。