CML-CP患者就診時外周血細胞分析可見白細胞（WBC）總數(shù)顯著升高,，血小板（PLT）計數(shù)正?；蛏摺Ｈ斯し诸惪梢姼麟A段粒細胞,，以中,、晚幼為主，嗜堿性和嗜酸性粒細胞比例多增高,。進入加速期（AP）或急變期（BC）后,，患者可出現(xiàn)WBC計數(shù)增高并難以控制，Hb濃度進行性下降,，PLT計數(shù)增高或減低,，外周血分類可出現(xiàn)原始細胞或者嗜堿性粒細胞增高。血液學監(jiān)測對于準確判斷病情,、評估療效,、識別藥物的血液學不良反應并及時進行相應處理有重要的意義。CML患者的血液學監(jiān)測以外周血細胞計數(shù)和人工分類為主,，在初次診斷及病情可能出現(xiàn)進展時必須進行骨髓細胞學的分析,，進展期患者應定期進行骨髓細胞學檢測。完全血液學反應（CHR）是CML患者最基本的治療目標之一,，其定義為：外周血WBC<10×109/L,，PLT<450×109/L,，外周血人工分類無不成熟粒細胞，嗜堿性粒細胞<5%,，無CML的癥狀和體征,，脾臟不能觸及。接受TKI治療后3個月未獲得CHR為治療失敗的指征之一,。CML患者確診后通常每1-2周進行1次外周血細胞計數(shù)和分類檢測,，獲得CHR后可每3個月監(jiān)測1次。CML患者接受TKI治療初期,，為早期識別TKI的血液學不良反應,，可適當增加血液學監(jiān)測的頻率。進展期患者或CML-CP患者病程中出現(xiàn)可疑的疾病進展跡象時,，應及時進行血液學監(jiān)測,。 約95%的CML患者經常規(guī)核型分析可檢出t(9;22)(q34;q11)，其余的5%患者需經熒光原位雜交（FISH）或逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測檢出BCR-ABL融合基因,。約90%的CML-CP患者為46,t(9;22)假二倍體核型,，10%的患者除t(9;22)外還有-Y、 8,、i(17q)或 Ph等附加染色體異常,。CML-AP和CML-BC患者伴有附加染色體異常的比例達40-70%。CML-CP患者病程中出現(xiàn)染色體克隆演變,，也是進入AP的診斷依據(jù)之一,。CML患者的細胞遺傳學反應應根據(jù)患者骨髓細胞中期分裂相中Ph染色體的比例確定，可分為以下5個級別：完全細胞遺傳學反應（CCyR）：無Ph中期分裂相,；部分細胞遺傳學反應（PCyR）：Ph中期分裂相比例為1-35%,；次要細胞遺傳學反應（minorCyR）：Ph中期分裂相比例為36-65%；微小細胞遺傳學反應（miniCyR）：Ph中期分裂相比例為66-95%,；無細胞遺傳學反應（noCyR）：Ph中期分裂相比例>95%,。CML患者細胞遺傳學檢測方法包括顯帶法染色體檢測和熒光原位雜交技術（FISH）。染色體檢測的標本來源以骨髓為宜,，當骨髓穿刺失敗時,，如外周血WBC＞10×109/L且原始細胞 幼稚細胞比例>10%，也可采用外周血細胞作為檢測標本,。FISH檢測通常以外周血或骨髓制備的染色體懸液為標本來源，新鮮的骨髓涂片或外周血涂片也作為FISH的標本來源,?？鼓齽┩ǔ＿x擇肝素鈉，肝素鋰尤其是EDTA可對細胞的活性產生不利影響,。標本從患者體內抽取以后,，應盡快送至實驗室進行處理,，以當天或24h內送達為宜，夏季和冬季應采取措施防止運輸過程中標本溫度過低或過高,。標本按常規(guī)方法計數(shù),、接種、培養(yǎng)和收獲,，并以熱變性R顯帶技術或G顯帶技術進行顯帶,。核型分析需分析≥20個中期分裂相。核型結果需遵循《人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN）2013》進行描述,。CML患者初診時應進行骨髓細胞遺傳學分析,。疑診CML的患者核型分析失敗或未檢出Ph染色體時，應用BCR-ABL探針進行FISH檢測有助于確定CML的診斷,。在TKI治療開始后3個月,、6個月、12個月應進行細胞遺傳學反應的評估,。獲得CCyR后,，無法進行國際標準化（IS）RQ-PCR進行BCR-ABL監(jiān)測的患者應每12個月進行骨髓細胞遺傳學監(jiān)測，采用RQ-PCR（以BCR-ABLIS表示）監(jiān)測的患者,，若持續(xù)保持主要分子學反應（MMR）可忽略骨髓細胞遺傳學檢測,，而未達MMR或喪失MMR的患者應每12-18個月檢測1次。根據(jù)ELN2013年推薦,，CML患者在獲得CCyR后,，可采用FISH檢測外周血間期細胞替代常規(guī)骨髓染色體檢查，通常需分析>200個細胞,，CCyR的定義為Ph陽性細胞<1%,。CML患者TKI治療失敗或出現(xiàn)疾病進展時，應及時進行包括骨髓細胞遺傳學檢測在內的全面評估,。CML患者TKI療效未達最佳反應時,，應增加細胞遺傳學和分子學監(jiān)測的頻率。接受TKI治療的CML患者出現(xiàn)骨髓病態(tài)造血或不能用其他原因解釋的血細胞減少等骨髓增生異常綜合征（MDS）表現(xiàn)時,，應進行骨髓細胞遺傳學及其他相關檢測,。約2.4%～10%的CML患者接受TKI治療后，可出現(xiàn)Ph-的克隆性染色體異常,，其中伴有累及7號染色體異常的患者易向MDS進展,，需加強骨髓細胞遺傳學檢測的頻率。分子學檢測包括采用RQ-PCR技術檢測BCR-ABL 轉錄本水平及PCR結合直接測序技術檢測BCR-ABL酪氨酸激酶區(qū)點突變,。CML患者的骨髓和外周血均可用于診斷及治療過程中的分子學監(jiān)測，但建議治療過程中一直采用外周血監(jiān)測BCR-ABL 轉錄本水平,。標本采集量根據(jù)白細胞計數(shù)相應調整,，對于白細胞計數(shù)正常的患者，抽取不少于8毫升的外周血標本,。采用EDTA或枸櫞酸鈉抗凝標本,。標本抽取后4℃運輸和存放，并于24h內處理,。通過裂解紅細胞獲得有核細胞來提取RNA,，采用合適的裂解配方和裂解時間。RNA提取建議采用經典的TRIzol法,。逆轉錄時建議采用MMLV或Superscript逆轉錄酶,，并選擇隨機六聚體引物。CML患者均具有BCR-ABL融合基因,，95%以上為P210型BCR-ABL,，其余為P230、P190或變異型,?；颊叱踉\時需采用定性或RQ-PCR確定BCR-ABL類型。治療隨訪時需采用相應反應體系檢測BCR-ABL 轉錄本水平,。建議采用探針法進行RQ-PCR,。ABL是首選推薦的內參基因，也可以選擇BCR或GUS,。為評價患者是否獲得MR4.0,、MR4.5和MR5.0，ABL拷貝數(shù)分別要高于10,000,、32,000和100,000,。每批RQ-PCR試驗中均需以質粒為標準品制作標準曲線，質粒標準品拷貝數(shù)應介于102～106之間,。每一批RQ-PCR實驗均需要有陽性和陰性對照,。陽性對照同時作為室內批間質控樣品，包括高拷貝及低拷貝兩種,，二者的BCR-ABL 轉錄本水平差別應在3-log左右,。通過每批實驗使用相同的質控樣品來監(jiān)測RQ-PCR穩(wěn)定性。每份待測樣品的BCR-ABL及ABL均應做平行管檢測或至少低拷貝樣品重復檢測,。使用BCR-ABLIS來反映BCR-ABL（P210）轉錄本水平以正確評價患者療效,。建議實驗室在檢測體系穩(wěn)定后盡早獲得有效的轉換系數(shù)（CF）以轉換BCR-ABLIS，并通過定期的評估即室間質控樣品比對校正來保證CF持續(xù)準確,。此外,，CF僅適用于具有P210型BCR-ABL的CML患者轉換后BCR-ABLIS≤10%的轉換,。只有高質量的cDNA樣本才能保證突變檢測結果的可靠性,。建議選用巢式PCR擴增,，首先擴增BCR-ABL，再擴增BCR-ABL上的ABL,。PCR產物盡可能覆蓋目前已報道的有臨床意義的突變,，建議至少能夠準確檢測ABL上第240-490號氨基酸密碼子。選用高保真的DNA聚合酶,。建議采用直接測序法雙向測序,，測序圖譜應完整且背景干凈。根據(jù)與參比序列比對的結果及測序圖譜判定點突變結果,，排除SNP位點及非特異性結果,。除了患者的基本信息外，BCR-ABL 轉錄本水平報告的內容還應包括：①結果是否正常（陽性/陰性）,；②BCR-ABL和ABL的拷貝數(shù),；③BCR-ABL 轉錄本水平檢測值，以（BCR-ABL拷貝數(shù)/ABL拷貝數(shù)）×100％的百分數(shù)格式表示,；④在獲得有效CF后,，通過BCR-ABL檢測值×CF得出BCR-ABLIS，在BCR-ABLIS≤10%時報告,，若>10%,，可以以BCR-ABLIS>10%形式而不以具體數(shù)值報告；⑤對于ABL拷貝數(shù)不合格及有質量問題的標本,，要提示,；⑥建議報告中包括不同治療時間點BCR-ABLIS動態(tài)變化曲線。BCR-ABL酪氨酸激酶區(qū)點突變的報告內容還應包括：①是否檢測到突變,；②突變的氨基酸位點及類型,；③突變的堿基類型。TKI開始治療時每3個月1次,；獲得MMR后,，每3-6個月進行監(jiān)測；當BCR-ABL 轉錄本水平介于最佳反應及治療失敗之間,，即“警告”時,，應增加檢測的頻率；當BCR-ABL 轉錄本水平明顯增高并喪失MMR時,，患者應盡早接受復查,。
3.6.2 BCR-ABL酪氨酸激酶區(qū)點突變檢測的時機初診CML-CP患者可以不進行突變檢測，AP和BC期患者可在TKI治療前進行突變檢測,；CML患者在TKI治療中,，未獲得最佳療效、達治療失敗或出現(xiàn)病情進展時，應進行BCR-ABL激酶區(qū)突變檢測,，特別是在考慮選擇尼洛替尼或達沙替尼作為二線治療前,，以指導選擇敏感的TKI。二線治療后未達到最佳療效的患者亦應進行突變檢測,。3.6.3 BCR-ABL酪氨酸激酶區(qū)點突變類型對TKI藥物選擇的指導意義BCR-ABL激酶區(qū)突變類型繁多,，目前已超過80種。伊馬替尼,、尼洛替尼和達沙替尼對部分BCR-ABL激酶區(qū)突變類型有不同的敏感性,。目前已發(fā)現(xiàn)的突變類型中，T315I對三種TKI均耐藥,；超過一半的突變型對伊馬替尼耐藥,；V299L、F317L/V/I/C和T315A對達沙替尼耐藥,；Y253F/H,、E255K/V和F359V/I/C 對尼洛替尼耐藥。對于其他突變類型,，可以參考已報道的IC50數(shù)據(jù)及患者的其他因素選擇TKI,。
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