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中華血液學(xué)雜志2014年8月第35卷第8期

制定者：

中華醫(yī)學(xué)會血液學(xué)分會實驗診斷學(xué)組

中國慢性髓性白血病聯(lián)盟專家組

近幾年，血液學(xué),、細胞遺傳學(xué)和分子學(xué)監(jiān)測已成為慢性髓性白血?。–ML）治療的重要組成部分。中華醫(yī)學(xué)會血液學(xué)分會、中國CML聯(lián)盟組織專家根據(jù)國外指南或推薦,，結(jié)合國內(nèi)研究經(jīng)驗,，起草制定了中國CML診療監(jiān)測規(guī)范，以期為國內(nèi)血液科醫(yī)師提供有關(guān)CML診療的重要參考,。

一,、 CML療效監(jiān)測的臨床意義

CML是首個被識別的發(fā)病與特定染色體或基因相關(guān)的腫 瘤 性 疾 病 ，其 標 志 性 特 征 為 Ph 染 色 體 ,，即 t(9;22)(q34;q11),，致病基礎(chǔ)為位于 9q34 上的 c-ABL 易位至 22q11上BCR基因3′端，形成BCR-ABL融合基因,。

下圖為小編補充：

CML治療從化療時代的追求緩解癥狀或血液學(xué)反應(yīng),，到干擾素時代的追求細胞遺傳學(xué)反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)樵煅杉毎浦玻℉SCT）和酪氨酸激酶抑制劑（TKI）時代的追求分子學(xué)反應(yīng),，體現(xiàn)了CML診療和監(jiān)測理念的變更,。

干擾素使得少數(shù)Ph染色體減少或消失的患者生存期顯著 延 長 ，顯示了細胞遺傳學(xué)監(jiān)測的意義,。HSCT 后BCR-ABL基因轉(zhuǎn)錄本持續(xù)陽性或高水平表達,、由陰性變?yōu)殛栃曰虮磉_水平逐漸升高預(yù)示疾病復(fù)發(fā)，體現(xiàn)了分子學(xué)監(jiān)測的重要性,。在接受TKI 治療后,， 80%～90%新診斷CML慢性期（CP）患者獲得了完全細胞遺傳學(xué)反應(yīng)（CCyR），高度敏感的實時定量PCR （RQ-PCR）技術(shù)成為評估CCyR患者體內(nèi)白血病負荷的唯一手段,。大量研究證實,， TKI治療早期（3、 6和12個月）的細胞遺傳學(xué)或分子學(xué)反應(yīng)程度與患者遠期的無疾病進展生存（PFS）和總生存（OS）有顯著相關(guān)性：

①治療3個月時能否達到國際標準化 BCR-ABL（BCR-ABLIS）<>

② 6個月達到CCyR預(yù)示最佳療效,， 

③ 12個月獲得CCyR與OS期顯著延長相關(guān),， 

④ 12或18個月獲得主要分子學(xué)反應(yīng)（MMR）與長期無事件生存顯著相關(guān)；

治療中如喪失曾經(jīng)獲得的最佳血液學(xué),、細胞遺傳學(xué)或分子學(xué)反應(yīng),、出現(xiàn)新的 Ph陽性染色體克隆演變或ABL突變，提示治療失敗或疾病進展,。在導(dǎo)致TKI 治療失敗或耐藥的機制中,， BCR-ABL酪氨酸激酶區(qū)點突變最為多見，占耐藥患者的 30%~80%,，耐藥細胞的突變類型與TKI 克服耐藥的能力密切相關(guān),，因此需要根據(jù) ABL突變檢測結(jié)果調(diào)整治療策略。目前,， TKI 治療中 3,、 6,、 12 個月以及之后任意時間點的血液學(xué)、細胞遺傳學(xué)和分子學(xué)反應(yīng)已被列入國內(nèi)外CML診療推薦或指南的 TKI 反應(yīng)評估標準,，不僅用于評估療效,，更重要的是為了早期識別耐藥或疾病進展，從而指導(dǎo)干預(yù)治療,。下文將對血液學(xué),、細胞遺傳學(xué)及分子學(xué)監(jiān)測予以分別闡述。

二,、 CML療效的監(jiān)測

（一）CML的血液學(xué)監(jiān)測
1. CML 的血液學(xué)異常及監(jiān)測方法： 

CML-CP 患者就診時外周血細胞分析可見 WBC 顯著升高,，PLT 正常或升高,。人工分類可見各階段粒細胞,，以中、晚幼粒細胞為主,，嗜堿和嗜酸粒細胞比例多增高。進入加速期（AP）或急變期（BC）后,，患者可出現(xiàn) WBC 增高并難以控制,， HGB 進行性下降，PLT增高或減低,，外周血分類可出現(xiàn)原始細胞或者嗜堿粒細胞增高,。血液學(xué)監(jiān)測對于準確判斷病情、評估療效,、識別藥物的血液學(xué)不良反應(yīng)并及時進行相應(yīng)處理有重要的意義,。CML 患者的血液學(xué)監(jiān)測以外周血細胞計數(shù)和人工分類為主，在初次診斷及病情可能出現(xiàn)進展時必須進行骨髓細胞學(xué)的分析,，進展期患者應(yīng)定期進行骨髓細胞學(xué)檢測,。

2. 完全血液學(xué)反應(yīng)（CHR）的定義：

CHR是CML患者最基本的治療目標之一，其定義為外周血 WBC < 10="" ×="" 10e9/l,，plt="">< 450="" ×=""><0.05,，無 cml="">

3. 血液學(xué)監(jiān)測的時機： 

CML患者確診后通常每1~2周進行1次外周血細胞計數(shù)和分類檢測,，獲得CHR后可每3個月監(jiān)測1次,。CML患者接受TKI治療初期，為早期識別TKI的血液學(xué)不良反應(yīng),，可適當增加血液學(xué)監(jiān)測的頻率,。進展期患者或CML-CP患者病程中出現(xiàn)可疑的疾病進展跡象時，應(yīng)及時進行血液學(xué)監(jiān)測,。

（二） CML的細胞遺傳學(xué)監(jiān)測
1. CML的細胞遺傳學(xué)異常：

約 95%的 CML患者經(jīng)常規(guī)核型分析可檢出t(9;22)(q34;q11),，其余5%的患者需經(jīng)熒光原位雜交（FISH）或 RT-PCR 檢測檢出 BCR-ABL 融合基因,。
約 90%的 CML-CP患者為 46，t(9;22)假二倍體核型,， 10%的患者除t(9;22)外還有-Y,、 +8、 i(17q)或+Ph等附加染色體異常,。CML-AP和 CML-BC患者伴有附加染色體異常的比例達 40%~70%,。CML-CP 患者病程中出現(xiàn)染色體克隆演變，也是進入AP的診斷依據(jù)之一,。

2. 細胞遺傳學(xué)反應(yīng)的定義： 

CML患者的細胞遺傳學(xué)反應(yīng) 應(yīng)根據(jù)患者骨髓細胞中期分裂象中 Ph 染色體的比例確定,，可分為以下 5個級別： 

①CCyR：無 Ph中期分裂象； 

②部分細胞遺傳學(xué)反應(yīng)（PCyR）： Ph染色體中期分裂象比例為1% ~ 35%,； 

③次要細胞遺傳學(xué)反應(yīng)（minorCyR）： Ph染色體中期分裂象比例為36% ~ 65%,； 

④微小細胞遺傳學(xué)反應(yīng)（miniCyR）：Ph染色體中期分裂象比例為 66% ~ 95%； 

⑤無細胞遺傳學(xué)反應(yīng)（noCyR）： Ph染色體中期分裂象比例>95%,。

3. CML細胞遺傳學(xué)檢測方法： 

CML患者細胞遺傳學(xué)檢測方法包括顯帶法染色體檢測和 FISH,。

染色體檢測的標本來源以骨髓為宜，當骨髓穿刺失敗時,，如外周血 WBC＞10 × 10e9/L且原始細胞+幼稚細胞比例>0.100,，也可采用外周血細胞作為檢測標本。

FISH檢測通常以外周血或骨髓制備的染色體懸液為標本來源,，新鮮的骨髓涂片或外周血涂片也作為FISH的標本來源,。抗凝劑通常選擇肝素鈉,，肝素鋰尤其是EDTA 可對細胞的活性產(chǎn)生不利影響,。標本從患者體內(nèi)抽取后應(yīng)盡快送至實驗室進行處理，以當天或 24 h 內(nèi)送達為宜,，夏季和冬季應(yīng)采取措施防止運輸過程中標本溫度過低或過高,。
標本按常規(guī)方法計數(shù)、接種,、培養(yǎng)和收獲,，并以熱變性 R顯帶技術(shù)或 G顯帶技術(shù)進行顯帶。核型分析需分析≥20個中期分裂象,。核型結(jié)果需遵循《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN） 2013》進行描述,。

4. 細胞遺傳學(xué)監(jiān)測的時機：

CML患者初診時應(yīng)進行骨髓細胞遺傳學(xué)分析。疑診 CML的患者核型分析失敗或未檢出 Ph染色體時,，應(yīng)用 BCR-ABL探針進行 FISH檢測有助于確定 CML的診斷,。在 TKI治療開始后 3、 6,、 12個月應(yīng)進行細胞遺傳學(xué)反應(yīng)的評估,。獲得 CCyR后,，無法通過國際標準化RQ-PCR進行 BCR-ABL監(jiān)測的患者應(yīng)每12個月進行骨髓細胞遺傳學(xué)監(jiān)測，采用 RQ-PCR（以 BCR-ABLIS表示）監(jiān)測的患者,，若持續(xù)保持 MMR可忽略骨髓細胞遺傳學(xué)檢測,，而未達MMR 或喪失 MMR 的患者應(yīng)每 12~18 個月檢測 1 次。根據(jù)ELN2013年推薦,， CML患者在獲得 CCyR后,，可采用 FISH檢測外周血間期細胞替代常規(guī)骨髓染色體檢查，通常需分析>200個細胞,， CCyR的定義為 Ph陽性細胞<>

CML 患者 TKI 治療失敗或出現(xiàn)疾病進展時,，應(yīng)及時進行包括骨髓細胞遺傳學(xué)檢測在內(nèi)的全面評估。CML 患者TKI 療效未達最佳反應(yīng)時,，應(yīng)增加細胞遺傳學(xué)和分子學(xué)監(jiān)測的頻率,。接受 TKI 治療的 CML患者出現(xiàn)骨髓病態(tài)造血或不能用其他原因解釋的血細胞減少等骨髓增生異常綜合征（MDS）表現(xiàn)時，應(yīng)進行骨髓細胞遺傳學(xué)及其他相關(guān)檢測,。2.4%～10.0%的 CML患者接受 TKI治療后,，可出現(xiàn) Ph-的克隆性染色體異常，其中伴有累及 7號染色體異常的患者易向MDS進展,，需提高骨髓細胞遺傳學(xué)檢測的頻率,。

（三） CML的分子學(xué)監(jiān)測
分子學(xué)監(jiān)測包括采用 RQ-PCR技術(shù)檢測 BCR-ABL 轉(zhuǎn)錄本水平及 PCR 結(jié)合直接測序技術(shù)檢測 BCR-ABL 酪氨酸激酶區(qū)點突變。
1. 樣本采集,、送檢、 RNA 制備及逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA：

CML患者的骨髓和外周血均可用于診斷及治療過程中的分子學(xué)監(jiān)測 ,，但建議治療過程中一直采用外周血監(jiān)測BCR-ABL 轉(zhuǎn)錄本水平,。標本采集量根據(jù)白細胞計數(shù)相應(yīng)調(diào)整，對于白細胞計數(shù)正常的患者,，抽取不少于 8 ml的外周血標本,。采用 EDTA或枸櫞酸鈉抗凝標本。標本抽取后 4 ℃運輸和存放,，并于24 h內(nèi)處理,。通過裂解紅細胞獲得有核細胞來提取 RNA，采用合適的裂解配方和裂解時間,。RNA提取建議采用經(jīng)典的 TRI zol 法,。逆轉(zhuǎn)錄時建議采用 M-MLV或Superscript逆轉(zhuǎn)錄酶，并選擇隨機六聚體引物,。

2. 確定 BCR- ABL 融合基因類型： 

CML 患者均具有BCR-ABL融合基因,， 95%以上為 P210型 BCR-ABL，其余為P230,、 P190或變異型,?；颊叱踉\時需采用定性或 RQ-PCR確定 BCR-ABL 類型。治療隨訪時需采用相應(yīng)反應(yīng)體系檢測BCR-ABL 轉(zhuǎn)錄本水平,。

3. RQ-PCR檢測 BCR-ABL（P210）轉(zhuǎn)錄本水平：

建議采用探針法進行 RQ-PCR,。內(nèi)參基因可以選擇 ABL、 BCR 或GUS,。分子學(xué)反應(yīng)定義見表 1,。

為評價患者是否獲得MR4.0、 MR4.5 和 MR5.0,， ABL 拷貝數(shù)分別要高于 10 000,、32 000和 100 000。每批 RQ-PCR實驗中均需以質(zhì)粒為標準品制作標準曲線,，質(zhì)粒標準品拷貝數(shù)應(yīng)介于 10e2～10e6,。每一批 RQ-PCR實驗均需要有陽性和陰性對照。陽性對照同時作為室內(nèi)批間質(zhì)控樣品,，包括高拷貝及低拷貝兩種,，二者的BCR-ABL 轉(zhuǎn)錄本水平差別應(yīng)在 3個對數(shù)級左右。通過每批實驗使用相同的質(zhì)控樣品來監(jiān)測 RQ-PCR穩(wěn)定性,。每份待測樣品的 BCR-ABL及 ABL均應(yīng)做平行管檢測或至少低拷貝樣品重復(fù)檢測,。

使用 BCR-ABLIS來反映 BCR-ABL （P210）轉(zhuǎn)錄本水平以正確評價患者療效。建議實驗室在檢測體系穩(wěn)定后盡早獲得有效的轉(zhuǎn)換系數(shù)（CF）以轉(zhuǎn)換 BCR-ABLIS,，并通過定期的評估即室間質(zhì)控樣品比對校正來保證 CF持續(xù)準確,。此外，CF 僅適用于具有 P210 型 BCR-ABL,、轉(zhuǎn)換后 BCR-ABLIS≤10% CML患者的轉(zhuǎn)換,。

4. 直接測序法檢測 BCR-ABL酪氨酸激酶區(qū)點突變：

只有高質(zhì)量的 cDNA 樣本才能保證突變檢測結(jié)果的可靠性。建議選用巢式PCR擴增,，首先擴增BCR- ABL,，再擴增BCR-ABL上的ABL。PCR產(chǎn)物盡可能覆蓋目前已報道的有臨床意義的突變,，建議至少能夠準確檢測 ABL上第 240~490號氨基酸密碼子,。選用高保真的 DNA聚合酶。建議采用直接測序法雙向測序,，測序圖譜應(yīng)完整且背景干凈,。根據(jù)與參比序列比對的結(jié)果及測序圖譜判定點突變結(jié)果，排除SNP位點及非特異性結(jié)果,。

5. 結(jié)果報告：

除了患者的基本信息外,， BCR-ABL 轉(zhuǎn)錄本水平報告的內(nèi)容還應(yīng)包括： 

①結(jié)果是否正常（陽性/陰性）； 

②BCR-ABL 和 ABL 的拷貝數(shù),； 

③BCR-ABL 轉(zhuǎn)錄本水平檢測值,，以（BCR-ABL拷貝數(shù)/ABL拷貝數(shù)） ×100%的百分數(shù)形式表示,； 

④在獲得有效 CF后，通過 BCR-ABL檢測值×CF得出BCR-ABLIS,，在 BCR-ABLIS≤10%時報告,，若>10%，可以以BCR-ABLIS>10%形式而不以具體數(shù)值報告,；

⑤對于 ABL拷貝數(shù)不合格及有質(zhì)量問題的標本,，要提示； 

⑥建議報告中包括不同治療時間點 BCR-ABLIS動態(tài)變化曲線,。

BCR-ABL酪氨酸激酶區(qū)點突變的報告內(nèi)容還應(yīng)包括：

①是否檢測到突變,；

②突變的氨基酸位點及類型； 

③突變的堿基類型,。

6. TKI 治療CML患者分子學(xué)監(jiān)測的建議：
（1） BCR-ABL 轉(zhuǎn)錄本水平檢測時機： 

TKI 開始治療時每3 個 月 1 次 ,；獲 得 MMR 后 ，每 3~6 個 月 進 行 監(jiān) 測 ,；當BCR-ABL 轉(zhuǎn)錄本水平介于最佳反應(yīng)及治療失敗之間,，即“警告”時，應(yīng)增加檢測的頻率,；當 BCR-ABL 轉(zhuǎn)錄本水平明顯增高并喪失MMR時,，患者應(yīng)盡早接受復(fù)查。
（2） BCR-ABL 酪氨酸激酶區(qū)點突變檢測的時機：

初診CML-CP患者可以不進行突變檢測,， AP和 BC患者可在 TKI 治療前進行突變檢測,； CML患者在 TKI 治療中，未獲得最佳療效,、治療失敗或出現(xiàn)病情進展時,，應(yīng)進行BCR-ABL激酶區(qū)突變檢測，特別是在考慮選擇尼洛替尼或達沙替尼作為二線治療前,，以指導(dǎo)選擇敏感的 TKI。二線治療后未達到最佳療效的患者亦應(yīng)進行突變檢測,。
（3） BCR-ABL 酪氨酸激酶區(qū)點突變類型對 TKI 藥物選擇的指導(dǎo)意義： 

BCR-ABL激酶區(qū)突變類型繁多,，目前已超過80種。伊馬替尼,、尼洛替尼和達沙替尼對部分 BCR-ABL激酶區(qū)突變類型有不同的敏感性,。目前已發(fā)現(xiàn)的突變類型中，T315I 對三種 TKI 均耐藥,；超過一半的突變型對伊馬替尼耐藥,；V299L、F317L/V/I/C 和 T315A 對 達 沙 替 尼 耐 藥 ,；Y253F/H,、 E255K/V 和 F359V/I/C 對尼洛替尼耐藥,。對于其他突變類型，可以參考已報道的 IC50數(shù)據(jù)及患者的其他因素選擇TKI,。

三,、 CML監(jiān)測的展望

未來應(yīng)重視在TKI治療中的規(guī)范化監(jiān)測，并將這一理念在國內(nèi)血液科醫(yī)師和患者中大力普及,，使之常規(guī)監(jiān)測,。應(yīng)進一步推進中國 RQ-PCR國際標準化項目，在各地區(qū)建立技術(shù)可靠的標準實驗室,，以方便醫(yī)師和患者進行監(jiān)測,，并且方便交流或共享檢測結(jié)果。期待更方便,、快捷,、敏感、精確的定量PCR和突變檢測技術(shù)的日臻成熟,，進一步提高 CML治療中的監(jiān)測效能,，以指導(dǎo)或干預(yù)治療。TKI 的問世使 CML 已從一個惡性血液腫瘤轉(zhuǎn)成為一種慢性可控制性疾病,，未來有望逐漸走入社區(qū)醫(yī)院,。普及和推廣 CML的標準化、規(guī)范化監(jiān)測,，將為這一疾病的新型管理模式提供支撐和保障,。