病理學(xué)技術(shù)（pathological techniques）是病理學(xué)的一個(gè)重要分支，是病理學(xué)研究中的方法學(xué),，是病理診斷的基礎(chǔ),。常規(guī)病理是病理技術(shù)最重要的部分，任何病理診斷離不開(kāi)它,。

　　病理技術(shù)包括：1 常規(guī)病理 2 特殊染色 3 細(xì)胞學(xué)制片 4 免疫組化 5 分子病理學(xué)技術(shù) 6 電鏡技術(shù) 7 冰凍切片技術(shù)等,。

　　常規(guī)病理技術(shù)是研究形態(tài)學(xué)必不可缺少的重要方法之一，是現(xiàn)代病理新技術(shù)的基礎(chǔ),。

　　優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單易操作,，基本滿足日常工作需要（常規(guī)技術(shù)，常規(guī)染色）,。

　　常規(guī)病理技術(shù)流程包括：

　　1）固定 2）取材 3）再次固定 4）脫水（包括脫水,、透明、浸蠟） 5）包埋 6）切片 7）染色 8）封片

一,、取材

　　此步驟在技術(shù)員協(xié)助下由病理醫(yī)師完成,。取材的好壞，直接影響切片的質(zhì)量,。

　　醫(yī)生在取材時(shí),，首先要有一把鋒利的取材刀，在切割組織時(shí)要避免取材刀來(lái)回拖拉。

　　取材組織塊厚薄要均勻,，一般厚度以0.2～0.3cm為適,，體積不超過(guò)2x1.5x0.3cm。小組織或液體沉淀物：先用拭紙或?yàn)V紙妥為包裹,，然后放入專用小盒內(nèi)進(jìn)行4%中性緩沖甲醛固定,，切忌避免檢材遺失。

　　較易發(fā)脆的組織（如甲狀腺,、肝臟,、血塊、淋巴結(jié),、大塊癌組織等）可適當(dāng)厚一些,，而脂肪、纖維性腫瘤,、平滑肌腫瘤等致密的或試劑不易滲入的組織應(yīng)取薄一些,；淋巴需切開(kāi)淋巴結(jié)包膜，并盡量剔除周圍的脂肪組織,。在取材中還應(yīng)十分注意組織內(nèi)是否有縫線或骨組織,，如碰到不可避免的鈣化組織，應(yīng)與技術(shù)室講明,，骨組織應(yīng)先脫鈣再取材,。在切取纖維組織、肌肉組織,、胃腸道時(shí),，應(yīng)注意纖維及肌肉的走向，取材時(shí)盡可能按與纖維平行走向切取為佳,。

取材的注意事項(xiàng)：

　　1,、每例標(biāo)本取材前，取材醫(yī)生和技術(shù)人員共同核對(duì)該標(biāo)本的例數(shù),、內(nèi)容,、病變特征及其標(biāo)志是否與申請(qǐng)單一致。

　　2,、準(zhǔn)確無(wú)誤將病理標(biāo)本號(hào)用打號(hào)機(jī)或手工書(shū)寫(xiě)在脫水盒上方,，登記的病理標(biāo)本號(hào)必須與脫水盒上的號(hào)碼必須一致，如實(shí)清楚地將病理醫(yī)生的口頭描述記錄與電腦,。

　　3,、取材完畢后，取材醫(yī)生和技術(shù)人員共同核對(duì)取材組織塊及其編號(hào)準(zhǔn)確無(wú)誤后置入脫水盒內(nèi),，并在記錄單和取材工作單上簽名并簽署日期。

　　4,、核對(duì)無(wú)誤后放入脫水機(jī)進(jìn)行脫水,。

　　5,、脫水機(jī)試劑定期更換，保證脫水液的濃度,。

這是我們科萊卡SP300的脫水程序

　　二,、組織固定

　　準(zhǔn)確的病理檢測(cè)是診斷和制藥兩大領(lǐng)域的橋梁和關(guān)鍵依據(jù)，組織規(guī)范化固定是量化檢測(cè)的基礎(chǔ)和保證,。

　　Bencroft將組織固定劑分為：醛類,、氧化劑類、蛋白變性類等,。目前推薦使用10%中性緩沖福爾馬林（PH7.2-7.4）,，NBF能夠很好的保存細(xì)胞形態(tài)、蛋白,、核酸,，穿透力強(qiáng)，4h滲透深度3.7mm,，8h滲透4.7mm,，應(yīng)用最廣。

　　固定是技術(shù)工作的第一步,，組織固定不當(dāng)或不良對(duì)標(biāo)本造成的影響是無(wú)法糾正的彌補(bǔ)的,，也是在整個(gè)制片過(guò)程中無(wú)法彌補(bǔ)的一步。固定是良好組織切片的的基礎(chǔ),，特別是對(duì)后續(xù)診斷,、免疫/分子檢測(cè)及研究工作造成的不良影響是無(wú)法挽回的。

　　固定是通過(guò)添加劑讓組織中所有細(xì)胞及細(xì)胞外成分迅速死亡,，以避免細(xì)胞中溶酶體成分的破壞作用,，保持離體組織細(xì)胞與生活時(shí)相似，并防止細(xì)菌繁殖所致的腐爛,，保存蛋白質(zhì)與核酸的基本結(jié)構(gòu),。

　　固定的目的：

　　1、保持離體組織與生活時(shí)的形態(tài)相似,，抑制組織自溶及細(xì)菌繁殖所致的腐爛,。

　　2、使細(xì)胞內(nèi)的特殊物質(zhì)定位,，保持其原有結(jié)構(gòu),。如細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、酶等經(jīng)固定后可沉淀或凝固,。

　　3,、保持細(xì)胞內(nèi)組織抗原、DNA及RNA，便于進(jìn)一步特殊檢查,，如特殊染色,，免疫組織化學(xué)染色，細(xì)胞遺傳學(xué),，分子病理以及科研等,。

　　4、使組織硬化,，便于切片,。

　　5、可增強(qiáng)染色的作用,。便于光鏡下對(duì)細(xì)胞內(nèi)的不同成分進(jìn)行區(qū)分,。細(xì)胞內(nèi)的不同成分沉淀凝固后折光率及對(duì)染料的親和力有所不同，染色后可加以區(qū)分,。

　　6,、有利于診斷的準(zhǔn)確及相關(guān)科研的開(kāi)展。

　　固定的方法：

　　1,、及時(shí)固定 2,、及時(shí)剖開(kāi) 3、特殊固定 4,、微波固定

　　組織固定的注意事項(xiàng)：

　　1,、適宜固定液的量 應(yīng)為組織的5-10倍，一般情況下固定液為組織的10倍以上為好,，大標(biāo)本不少于總體積的8倍,。

　　2、適宜的時(shí)間 組織固定越新鮮越好,。組織一經(jīng)離體,，就能及時(shí)地固定，這是最好的,。根據(jù)實(shí)驗(yàn),，如果要獲得某些酶的染色，固定最好在組織離體后30秒至1分鐘,。對(duì)于其它達(dá)不到要求是越快越好,，30分鐘之內(nèi)。大多數(shù)組織應(yīng)在固定24h內(nèi)進(jìn)行取材,。

　　3,、適宜的取材 一般厚度原則上不超過(guò)5mm（2-3mm最為合適）的情況下固定時(shí)間為3-24h。

　　4,、適宜的溫度和攪拌 大多數(shù)組織在室溫（25度）固定,，在低溫如4度固定時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng),。全自動(dòng)組織脫水機(jī)可以施加恒定的溫度、適宜的攪拌和試劑循環(huán)功能使得組織在有限的時(shí)間內(nèi)完成固定過(guò)程,，一般情況下將固定的時(shí)間溫度控制在35度左右,。

　　5、適宜的容器 固定的容器相對(duì)要大,。

固定不足、脫水不足

　　固定不當(dāng)?shù)难a(bǔ)救措施：

　　1,、組織過(guò)厚,，固定液不足造成組織中心未固定，先將組織切薄后逐級(jí)退回到80%乙醇,，水洗后再用10%NBF重新固定3h再進(jìn)行常規(guī)脫水處理即可,。

　　2、組織已經(jīng)干涸的標(biāo)本：組織干涸的標(biāo)本可采用AF液作為固定劑,，AF固定劑中的乙醇能使結(jié)締組織膨脹再進(jìn)行脫水透明浸蠟,，整個(gè)過(guò)程時(shí)間要縮短。

　　3,、未固定好就直接脫水的組織：多發(fā)生于小組織,，可在切片脫蠟至水后，用AFA固定液浸泡5-10min,，再進(jìn)行染色會(huì)達(dá)到一定效果,。

　　三、脫水

　　脫水就是利用脫水劑將組織內(nèi)的水分置換出來(lái),，以利于有機(jī)溶劑的滲入,，這一過(guò)程稱為脫水。常用的脫水劑是乙醇,。

　　脫水原則：1.將組織內(nèi)水分脫干凈但又不使組織硬化,；2.乙醇脫水應(yīng)由低濃度至高濃度進(jìn)行。

　　低濃度酒精在組織中穿透力很強(qiáng),，比高濃度更易滲透到組織內(nèi)部,。組織蠟塊脫水不盡，與空氣接觸后會(huì)出現(xiàn)凹陷,。

　　四,、透明

　　為了使石蠟浸入到組織塊內(nèi)，必須經(jīng)過(guò)一種既能與脫水劑混合,，又能與石蠟相溶的媒介物質(zhì),，這個(gè)過(guò)程稱透明。常用的透明劑是二甲苯,。二甲苯是乙醇和石蠟最好的媒介劑,。

　　一般組織30分鐘（3mm厚度組織）,，較大組織一般控制在2小時(shí)以內(nèi)。

　　組織塊透明不徹底,，呈白色渾濁狀態(tài),，需再放入脫水劑中，待徹底脫水才能透明,。

固定,、脫水問(wèn)題：細(xì)胞核不上色

　　五、浸蠟

　　組織透明后,，在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過(guò)程稱為浸蠟,。浸蠟溫度控制在58～62℃左右，略高于石蠟的熔點(diǎn),。

　　六,、包埋

　　是用包埋劑來(lái)支持組織的過(guò)程，最常用的是石蠟包埋法,，包埋的關(guān)鍵一是平整,，二是方位。要求在包埋時(shí),，應(yīng)采用鑷子輕壓組織塊拱起部份,，使之平貼于底部，通常采用 組織的最大面包埋,。囊壁,、管腔組織應(yīng)豎直包埋。小塊多顆組織,，應(yīng)盡量放在一起,，并保證在一個(gè)平面上。包埋時(shí)還應(yīng)注意有無(wú)縫線,，紙絮,，如有一定要去除。

　　包埋的注意事項(xiàng)：

　?、賾?yīng)將組織塊嚴(yán)格分件包埋,。包埋時(shí)一定要首先認(rèn)真核對(duì)組織塊的病理號(hào)（包括亞號(hào)）、塊數(shù)和取材醫(yī)師對(duì)包埋面的要求,，發(fā)生包埋差錯(cuò)時(shí),，必須立即與取材醫(yī)師和病理科當(dāng)班負(fù)責(zé)人取得聯(lián)系，及時(shí)處置,。

　?、诒仨殗?yán)防各種異物污染，勿將無(wú)關(guān)組織（包括縫線,、紙屑或其他異物（尤其是硬質(zhì)異物）埋入蠟塊內(nèi),。

　?、郯襁^(guò)程要操作迅速，以免組織塊尚未埋妥前熔蠟?zāi)獭?/span>

　?、馨裼玫娜巯瀾?yīng)純凈,，熔點(diǎn)適宜。浸蠟Ⅰ用軟蠟（熔點(diǎn)為45-50℃）,，浸蠟Ⅱ,、Ⅲ和包埋用蠟均用硬蠟（熔點(diǎn)為56-58℃）。

　?、莅裼萌巯炇褂们皯?yīng)將先靜置沉淀,、過(guò)濾。

　?、奕巯灂r(shí)不得使用明火，以防燃燒,。包埋用熔蠟的溫度應(yīng)<65℃,；包埋用的鑷子不可加溫過(guò)高，以免燙傷組織,。

　?、呓M織包埋時(shí)按壓平整。聚集包埋,。

七,、切片、烤片

　　用切片機(jī)將包埋有組織的蠟塊切成薄片,。切片厚度一般為4－6微米,，切片的要求是完整、薄,、均勻,。病理切片技術(shù)的精確度直接影響診斷的準(zhǔn)確性。

　　展片水溫應(yīng)在42℃至47℃之間,，確保組織上的皺摺充分展開(kāi),。

　　皺褶展開(kāi)的要點(diǎn)：第一、可以在切片時(shí)邊切邊向蠟片吹氣,，這樣的片子就會(huì)非常平整,，放到熱水里就會(huì)自然展開(kāi)，比較方便快捷,，但這樣的片子會(huì)略微厚一點(diǎn),；第二、在切完片子后,，先把切片放在30%酒精水溶液中,，讓酒精的張力自動(dòng)把皺摺展開(kāi),，然后再將切片移到熱水，這樣的片子會(huì)較?。ㄖ绢惤M織一碰到酒精就會(huì)散開(kāi),，故不能用此法）。第三,、最后撈片時(shí)玻片要干凈,，要選擇那些完整、無(wú)皺摺的切片,，粘貼于玻片中1/3和下1/3的中間,。

　　烤片和脫蠟  一般在65℃的溫箱內(nèi)烤片25分鐘左右。溫度過(guò)高,，會(huì)引起切片細(xì)胞收縮,；時(shí)間太短（少于20分鐘），容易造成脫片,。脫蠟也相當(dāng)重要,，如果脫蠟不干凈，切片不易著色或著色不勻,，所以,，脫蠟用的二甲苯要經(jīng)常更換，一般用3道二甲苯,，每500ml液體,，處理500張切片后更換一次為宜。當(dāng)室溫低于18℃時(shí),，必須將切片從溫箱拿出后立即放入二甲笨,。

粗切不當(dāng)導(dǎo)致的“空洞”假象

　　八、染色

　　常規(guī)染色或HE（Haematoxylin and eosin）染色,。它是病理技術(shù)中最常用的一種染色方法,，通過(guò)它可以做出病理診斷和發(fā)現(xiàn)尋求別的輔助方法，以達(dá)到準(zhǔn)確,，完整的病理診斷,。

　　（1）,、染色目的：病理學(xué)的所有切片,，都必須通過(guò)一種以上的染料，通過(guò)各種不同的方法,，將切片中各種不同的物質(zhì),，在不同染液的作用下，將其顯示出來(lái),，使之在光學(xué)顯微鏡下,，能夠完全的觀看各種結(jié)構(gòu),。例如，HE染色,，好質(zhì)量的切片可以清晰地顯示出許多不同的結(jié)構(gòu),，細(xì)胞核著藍(lán)黑色，細(xì)胞漿著粉紅色,，軟骨著藍(lán)色等,。清晰的結(jié)構(gòu)為診斷提供可靠的依據(jù)，因此,，染色技術(shù)也是病理技術(shù)中的重要組成部分,，必須不斷地總結(jié)，方能提高,。如果染色不好,，切片染色一團(tuán)糟，紅藍(lán)不分,，結(jié)構(gòu)不清,，層次不明，影響了鏡下的觀察,，直接影響了病理診斷，染色結(jié)果的好壞直接關(guān)系到診斷的準(zhǔn)確性,。　　

　?。?）、染色方法及步驟

　　1.人工蘇木素,，伊紅染色法（HE法）

　?。?）切片浸入二甲苯中5-10min。

　?。?）切片浸入二甲苯中5-10min,。

　　（3）100%酒精1min,。

　?。?）100%酒精1min。

　?。?）95%酒精1min,。

　　（6）95%酒精1min,。

　?。?）90%酒精1min。

　?。?）80%酒精1min,。

　?。?）自來(lái)水洗1min。

　?。?0）浸入蘇木素染液浸染10-15min,。

　　（11）自來(lái)水洗30second-1min,。

　?。?2）1%鹽酸酒精分化2-5second。

　?。?3）流水沖洗10-15min,，或返藍(lán)液30s-1min，水洗5分鐘,。

　?。?4）1%伊紅3-5min。

　?。?5）自來(lái)水洗,。

　　（16）80%酒精1-2s,。

　?。?7）95%酒精2-3min。

　?。?8）95%酒精2-3min,。

　　（19）無(wú)水酒精3-5min,。

　?。?0）無(wú)水酒精3-5min。

　?。?1）二甲苯3-5min,。

　　（22）二甲苯3-5min,。

　?。?3）中性樹(shù)膠封固。

　　九,、封片

　　切片染色完成后,，從低濃度的酒精到高濃度的酒精脫水。濃度低的酒精比濃度高的酒精更容易脫水,，但也容易使伊紅退色,，故脫水時(shí)間可短一點(diǎn)，切片經(jīng)二甲苯透明后，用中性樹(shù)膠封固,。

　　為增加切片的透明度,，防止細(xì)胞收縮、龜裂或切片出現(xiàn)黑色結(jié)晶樣小點(diǎn),。所以切片必須濕封,。隨著自動(dòng)封片機(jī)的應(yīng)用，完美解決了封片溢膠問(wèn)題,。

　　粘貼標(biāo)簽,，標(biāo)簽必須貼于玻片左側(cè)，編號(hào)打印清晰,。

　　十,、染色結(jié)果

　　細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì),、肌纖維,、膠原纖維、和紅細(xì)胞呈不同程度的紅色,。

組織脫蠟時(shí)間以二甲苯使用時(shí)間和室溫而定

蘇木精殘?jiān)孜皆诤叙ひ旱慕M織,，黏附上無(wú)法去除，須過(guò)濾蘇木精染液后重新切片,、染色

　　十一,、組織切片制備的質(zhì)量控制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

　　1.組織制片過(guò)程中，應(yīng)確保切片號(hào)與蠟塊號(hào)一致,。

　　2.制片工作一般應(yīng)在取材后2個(gè)工作日內(nèi)完成（不含脫鈣,、脫脂等特殊自理的標(biāo)本）。

　　3.制片完成后,，技術(shù)人員應(yīng)檢查制片質(zhì)量,，并加帖標(biāo)有本病理科病理號(hào)的標(biāo)簽,。常規(guī)石蠟包埋—HE染色片的優(yōu)良率（甲,、乙級(jí)切片所占的比例）≥90%，優(yōu)級(jí)率（甲級(jí)切片所占的比例）≥35%,。不合格切片應(yīng)立即重做,。

病理常規(guī)石蠟包埋HE染色切片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及評(píng)分表

注：切片質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：
　　 甲級(jí)片：≥90分（優(yōu)）；乙級(jí)片：75～89分（良）,；

　　丙級(jí)片：60～74分（基本合格）,；丁級(jí)片：≤59分（不合格）