| 光學(xué)顯微標(biāo)本的制作技術(shù) 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?了解光學(xué)顯微鏡切片制作技術(shù)的基本方法步驟,。 【實(shí)驗(yàn)原理】 采用光學(xué)顯微鏡研究一般生物體的內(nèi)部結(jié)構(gòu),，在自然狀態(tài)下是無(wú)法觀察清楚的,，多數(shù)動(dòng),、植物材料都必須經(jīng)過某種處理,，將組織分離成單個(gè)細(xì)胞或薄片,，光線才能通過細(xì)胞,。為了適應(yīng)這個(gè)需要,，就產(chǎn)生了光學(xué)顯微鏡制片技術(shù)。 光學(xué)顯微鏡的制片技術(shù)方法可分為兩大類：一類是非切片法,，另一類是切片法,。 非切片法,，是用物理或化學(xué)的方法，使細(xì)胞彼此分離,，如有分離法、涂布法,、壓碎法等。非切片法的操作比較簡(jiǎn)單,，能保侍細(xì)胞的完整,，但是細(xì)胞之間的正常位置往往被更動(dòng),，無(wú)法反映細(xì)胞之間的正常聯(lián)系,。它可以與切片法配合使用,，各取其長(zhǎng)處,。 切片法,，是利用銳利的刃具將組織切成極薄的片層,，材料須經(jīng)過一系列特殊的處理，如固定,、脫水,、包埋、切片,、染色等,，過程十分繁復(fù)。在制作過程中,，還要經(jīng)過一系列的物理和化學(xué)的處理,，這些處理方法可根據(jù)各種不同材料的性質(zhì)要求進(jìn)行合理選擇。切片法雖然工序繁瑣,，技術(shù)復(fù)雜,，但是,，它最能保持細(xì)胞間的正常的相互關(guān)系，能較好和較長(zhǎng)時(shí)間地保留細(xì)胞的原貌,，所以仍然是光學(xué)顯微鏡的主要制片方法,。 【實(shí)驗(yàn)儀器,、材料和試劑】 （一）儀器：石蠟切片機(jī),、恒溫蠟箱,、載玻片、蓋玻片 （二）材料：洋蔥根或小鼠肝 （三）試劑：乙醚,、無(wú)水乙醇、甲醛,、冰醋酸、苦味酸,、重鉻酸鉀,、鋨酸、正丁醇,、二甲苯,、石蠟,、甘油,、雞蛋、紗布,、加拿大樹膠,、麝香草酚 【方法與步驟】 光學(xué)顯微鏡切片制作技術(shù)最簡(jiǎn)單的切片法是徒手切片，但是由于組織塊往往十分柔軟,， 18 切削很困難,，而且無(wú)法得到十分菲薄的切片，因此必須先用某些特殊物質(zhì)滲入組織塊的內(nèi)部起支持作用,，并將整個(gè)組織塊包住，然后再用精密的切片機(jī)制作切片,，才能獲得良好的效果,。這種方法稱為包埋法，包埋的物質(zhì)稱為包埋劑,。常用的包埋劑有石蠟,、火棉膠、炭蠟,、明膠等,，水和塑料也可作為包埋劑,。根據(jù)包埋劑的不同，分別有石蠟切片,、火棉膠切片,、冰凍切片等，它們各有長(zhǎng)處,，可以根據(jù)需要選用,，但是使用得最多的還是石蠟切片技術(shù),。 石蠟作為包埋劑,，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn),，例如：石蠟?zāi)芮谐鰳O薄的蠟片（2～10μm）,；切片時(shí)能連成蠟帶，便于制作連續(xù)切片,；操作較容易,，組織塊可以包埋在石蠟中長(zhǎng)期保存,。然而石蠟切片的制作過程較長(zhǎng),，步驟很多，一步不慎往往導(dǎo)致前功盡棄,，而且這些處理引起組織塊或多或少地收縮，切片時(shí)受濕度影響比較大,，這些不足之處必須在制片過程中認(rèn)真對(duì)待,，盡量減小它的不良影響,。 石蠟切片的制作過程主要包括：取材，固定,，脫水,，透明,，透蠟，包埋,，切片,，貼片,，染色，透明,，封藏等步驟,。 1．取材 材料的好壞直接影響到切片的質(zhì)量，無(wú)論取哪一種動(dòng)植物材料,，以下幾點(diǎn)是必須注意的,。 （1）植物材料選擇時(shí)須盡可能不損傷植物體或所需要的部分；動(dòng)物材料取用時(shí)常對(duì)動(dòng)物施以麻醉,，常用的麻醉劑有氯仿和乙醚,，或?qū)?dòng)物殺死后迅速取出所需要的組織。 （2）取材必須新鮮,，這一點(diǎn)對(duì)于從事細(xì)胞生物學(xué)研究尤為重要,，應(yīng)該盡可能割取生活著的組織塊，并隨即投入固定液,。 （3）切取材料時(shí)刀要銳利,，避免因擠壓細(xì)胞使其受到損傷。 （4）切取的材料應(yīng)該小而薄,，便于固定劑迅速滲入內(nèi)部,。一般厚度不超過2mm，大小不超過5×5mm2,。 2．固定 組織和細(xì)胞離開機(jī)體后,，在一定時(shí)間內(nèi)仍然延續(xù)著生命活動(dòng)，會(huì)引起病理變化直至歸于死亡,。為了使標(biāo)本能反映它生前的正常狀態(tài),，必須盡早地用某些化學(xué)藥品迅速地殺死組織和細(xì)胞，阻抑上述變化,，并將結(jié)構(gòu)成分轉(zhuǎn)化為不溶性物質(zhì),，防止某些結(jié)構(gòu)的溶化和消失。這種處理就是固定,。除了上述作用外,，固定劑會(huì)使組織適當(dāng)硬化以便于隨后的處理，還會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)部的折射系數(shù)并使某些部分易于染色,。 固定劑的作用對(duì)象主要是蛋白質(zhì),，至于其他成分如脂肪和糖，在一般制作時(shí)不加考慮,，如要觀察這些物質(zhì),，可用特殊的方法將其固定下來。 固定劑的作用表現(xiàn)在對(duì)材料體積的改變,、硬化的程度,、穿透的速度以及對(duì)染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小,，都依所固定的材料性質(zhì)而定,，同樣一種固定液對(duì)某一材料來說是良好的，但對(duì)另外一些組織可能就不很適用,。良好的固定劑必須具備的特征是：穿透組織的速度快,。，能將細(xì)胞中的內(nèi)含物凝固成不溶解物質(zhì),，不使組織膨脹或收縮以保持原形,，硬化組織的程度適中，增加細(xì)胞內(nèi)含物的折光度,，增加媒染和染色能力,，具有保存劑作用。 固定劑有簡(jiǎn)單固定劑和混合固定劑的劃分,。 簡(jiǎn)單固定劑即單一的固定劑,，常用的有乙醇、甲醛,、冰醋酸,、升汞、苦味酸,、鉻酸,、重鉻酸鉀和鋨酸。其中,，苦味酸,、升汞、鉻酸既能凝固細(xì)胞清蛋白,，又能凝固核蛋白,；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白,；甲醛,、餓酸和重鉻酸鉀對(duì)這兩種蛋白質(zhì)都不凝固。 簡(jiǎn)單固定劑的局限性較大,，如將其適當(dāng)混合,，制成復(fù)合固定劑可以取得更好的效果。常用的混合固定劑有： Bouin液（70份苦味酸飽和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）,、Zenker液（升汞5g＋重鉻酸鉀2.5g＋硫酸鈉1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸鎦水）,、Carnoy改良液（3份無(wú)水乙醇+1份冰醋酸）等,。固定劑的種類甚多,，我們必須依據(jù)各種固定劑的性能及制片的不同要求來加以選擇。 19 固定時(shí),，須注意以下幾點(diǎn)： （1）固定劑應(yīng)有足夠的量,，一般為組織塊體積的10～15倍,。 （2）如所固定的材料外表有不易穿透的物質(zhì)，可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘,，再移入水溶性的固定液,。 （3）材料固定后如不立即下沉，可將其中氣泡抽出,。 （4）固定時(shí)間依材料大小,、固定劑種類而異，可從1小時(shí)到幾十小時(shí),，有時(shí)中間需要更新固定劑,。某些固定劑對(duì)組織的硬化作用較強(qiáng)，作用時(shí)間應(yīng)嚴(yán)加控制,，不能過長(zhǎng),。 （5）一般固定劑都以新配制的為好，用過的不能再用,。有些混合固定劑由甲,、乙兩液合并者，一定要在使用前才混合,。 （6）固定完畢,，根據(jù)所用固定劑的不同，用水或乙醇沖掉殘留的固定劑,，以免固定劑形成沉淀,，影響以后組織塊的染色。 3．脫水 生物組織中含有大量的水分,，它和石蠟是不能相溶的,，致使在包埋時(shí)石蠟無(wú)法滲入組織內(nèi)部，因此須使用脫水劑將水分除盡,，這就是脫水的作用,。 脫水劑必須能與水以任何比例相混合。脫水劑有兩類：一類是非石蠟溶劑,，如乙醇,、丙酮等，脫水后必須再經(jīng)過透明,，才能透蠟包埋,；另一類是兼石蠟溶劑，如正丁醇,，脫水后即可直接透蠟,。 常用的脫水劑是乙醇，因?yàn)樗鼉r(jià)格便宜，易于得到,。為了避免劇烈的擴(kuò)散引起的組織的強(qiáng)烈收縮,，脫水步驟應(yīng)從低到高以一定的濃度梯度來進(jìn)行，一般組織從30％乙醇開始,，經(jīng)過50％,、70％、80％,、95％,、100％至完全脫水；對(duì)于一些柔軟的組織應(yīng)從15％開始,。脫水時(shí)間依據(jù)組織的類型和大小而定,，一般各級(jí)乙醇中放置45min到1h，如果中間須停頓,，應(yīng)使材料停留在70％乙醇中,，因?yàn)榈蜐舛纫掖家资菇M織變軟、解體,，高濃度乙醇有脆化組織作用,，放置時(shí)間不能過長(zhǎng)，另外,，脫水必須在有蓋瓶中進(jìn)行,，以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導(dǎo)致濃度降低而使脫水不徹底。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時(shí)停留其中,，如需長(zhǎng)期保存,，可加入等量的甘油。 丙酮也是很好的脫水劑,，其作用和用法與乙醇相同,，不過其脫水力和收縮力都比乙醇強(qiáng)。 甘油常用于藻類,、菌類及柔弱材料的脫水,。 二氧六環(huán)為無(wú)色的石蠟溶劑，對(duì)組織沒有收縮及硬化等不良后果,，但其蒸氣有毒,，使用時(shí)須小心。 正丁醇可與水及乙醇混合,，亦為石蠟溶劑,，其優(yōu)點(diǎn)是很少引起組織塊的收縮與變脆。 叔丁醇的性質(zhì),、作用和用法同于正丁醇,，但因其價(jià)格昂貴而很少使用,。 4．透明 組織塊用非石蠟溶劑脫水后必須經(jīng)過透明。透明劑能同時(shí)與脫水劑和石蠟混合,，它取代了脫水劑后，石蠟便能順利地滲入組織,。 透明劑的種類很多,，較常用的是二甲苯、甲苯,、苯,、氯仿、香柏油和苯胺油等,。 二甲苯作用較快,，透明力強(qiáng)，但組織塊在其中停留過久,，容易收縮變脆變硬,，同時(shí)若脫水不凈，就會(huì)引起不良后果,，在應(yīng)用時(shí)必須特別小心,。通常將組織塊先經(jīng)純乙醇與二甲苯的等體積混合液，再進(jìn)入純二甲苯,，這樣可減少上述的缺點(diǎn),。透明時(shí)間應(yīng)由組織大小而定，—般各級(jí)停留時(shí)間在30min至2h,，在純二甲苯中應(yīng)更換2次,，總時(shí)間則以不超過3h為宜。材料經(jīng)過透明,，會(huì)顯示出前一步脫水的效果如何,，若脫水徹底，組織則顯現(xiàn)透明狀態(tài),，如組織中有白色云霧狀,，說明脫水不凈，須返工處理,，但返工的效果往往不好,。使用二甲苯透明時(shí)，應(yīng)避免其揮發(fā)和吸收空氣中的水分,，并保持其無(wú)水狀態(tài),。 20 甲苯的一般性質(zhì)與二甲苯相似。用法亦同,，唯沸點(diǎn)較低,，透明較慢,，但不會(huì)使組織變脆。 苯的用法同于二甲苯,，對(duì)組織的收縮作用小,，但須警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿適于大塊組織的透明,。 5．透蠟和包埋 包埋用的石蠟,，熔點(diǎn)在50～60℃之間，應(yīng)根據(jù)材料本身的硬度,、切片的厚薄和當(dāng)時(shí)的氣溫條件來選用,。一般動(dòng)物材料最常用的石蠟熔點(diǎn)為52～56℃，植物材料的用54～58℃的,；切片薄的用58～60℃的,，切片厚的則用52～54℃的；室溫10～19℃時(shí)選用52～54℃的石蠟可順利切片,，冬季可用熔點(diǎn)46～48℃的石蠟,，夏季可選56～58℃的。 石蠟的優(yōu)劣與切片的成敗密切相關(guān),。鑒別石蠟質(zhì)量的方法是：將石蠟熔化后倒入紙盒使其凝結(jié)且無(wú)氣泡和裂痕,，30～35℃放置24h且無(wú)氣泡和不透明的晶狀小點(diǎn)出現(xiàn)，蠟塊裂面不呈顆粒狀,，切成薄片不碎成細(xì)粒,。這種石蠟即為品質(zhì)優(yōu)良。含有雜質(zhì)的新蠟或用過的廢蠟可清潔后再用,，方法是將石蠟放入鍋內(nèi),，加熱到開始冒白煙，然后用小火繼續(xù)加熱30min（注意別超過發(fā)火點(diǎn)）,，使其去除水分和揮發(fā)性雜質(zhì),，并在溫箱中過濾以去除灰塵等顆粒。 透蠟須在恒溫箱中進(jìn)行,，恒溫箱的溫度調(diào)節(jié)至高于石蠟熔點(diǎn)3度,，使經(jīng)過透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理,。純石蠟應(yīng)處理2～3次,，透蠟的時(shí)間依材料性質(zhì)而定，一般每次需15～30min,。 透明的關(guān)鍵是控制溫度的恒定,，切忌忽高忽低，溫度過低石蠟?zāi)虩o(wú)法滲透,，溫度過高使組織收縮發(fā)脆,。 包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中,。具體做法是；先準(zhǔn)備好紙盒（具體折法見圖1-3及說明）,，將熔蠟倒入盒內(nèi),，迅速用預(yù)溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下,，再輕輕提起紙盒,，平放在冷水中，待表面石蠟?zāi)毯罅⒓磳⒓埡邪慈胨?，使其迅速冷卻凝固，30min后取出,。 包埋用蠟的溫度應(yīng)略高于透蠟溫度,，保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要,，否則包埋塊中將會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶,。以后切片時(shí)引起碎裂。 6．切片 （1）石蠟塊的固著與整修 在包埋以后,，就可進(jìn)行切片,。包埋好的石蠟塊裝上切片機(jī)進(jìn)行切片前還須進(jìn)行固著和整修。 固著：一般旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)上都附有可固著石蠟塊的金屬小盤,，這也可用同樣大小的臺(tái)木替代,。用加熱的蠟鏟將包埋塊粘貼于固著物上，并使組織塊朝外,，便于以后迅速切出所需的片子,。 整修：用加熱的蠟鏟或刀片將固著的包埋塊四周修平，使上下兩面修成平行面,，常保留組織周圍附著寬2～3mm的石蠟,，而修好的蠟塊呈長(zhǎng)方形。還可削去一角以便于在蠟帶上識(shí)別切片,。 （2）切片機(jī)和切片刀 切片機(jī)是用來作各種組織切片的一種專門設(shè)計(jì)的精密機(jī)械,，常用的是旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)，它的夾物部分是上下移動(dòng)前后推進(jìn)的,，而夾刀部分則固定不動(dòng),。主要部件是安裝切片刀的刀臺(tái)、安裝包埋塊的標(biāo)本臺(tái)和控制切片厚度的微動(dòng)裝置,。切片時(shí)切片刀固定不動(dòng),，轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)輪，標(biāo)本臺(tái)上下運(yùn)動(dòng)并按調(diào)好的切片厚度向前推進(jìn)一定的距離,，組織塊上下運(yùn)動(dòng)一次,，便在刀片上得到一張合乎厚度要求的切片,。 切片刀與切片的質(zhì)量直接相關(guān)。切片前必須磨刀,，方法是：將切片刀裝上刀柄,、刀背夾、滴少許石蠟油在平滑的磨刀石上,，將刀貼著磨刀石以背向刀口方向磨,，使用完畢后應(yīng)及時(shí)用二甲苯將石蠟油擦凈。 （3）切片方法 切片前,，將刀口置放大鏡下觀察,，選擇刀口平整無(wú)缺刻的部分來進(jìn)行切削。將所要切的包埋塊固定在標(biāo)本臺(tái)上,，使包埋塊外切面與標(biāo)本夾截面平行,，并讓包埋塊稍露出一截。將刀臺(tái)推至外緣后松開刀片夾的螺旋,，上好刀片,，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，包埋塊上下邊與刀口平行,。在微動(dòng)裝置上調(diào)節(jié)切片要求的厚度,，調(diào)節(jié)時(shí)應(yīng)注意指針不可在兩個(gè)刻度之間，否則容易損傷切片機(jī),，將刀臺(tái)移至近標(biāo)本臺(tái)處,，讓刀口與組織切面稍稍接觸，這時(shí)就可以開始切片了,。方法是：右手轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)輪,，左手持毛筆在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蠟帶,，待蠟帶形成一定長(zhǎng)度后,，右手停止轉(zhuǎn)動(dòng)，持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起,，平放于襯有黑紙的紙盒內(nèi),，注意切片速度不宜太快，搖動(dòng)轉(zhuǎn)輪用力應(yīng)均勻,，防止切片機(jī)震動(dòng)厲害引起切片厚薄不均勻,，還應(yīng)注意轉(zhuǎn)動(dòng)的方向，以防標(biāo)本臺(tái)后移而切不到片子,。切片完畢,，應(yīng)及時(shí)用氯仿將切片機(jī)的有關(guān)部分擦凈。 （4）切片中存在的問題及補(bǔ)救方法 石蠟切片是很不容易掌握的,，有時(shí)很容易成功,，有時(shí)則由于某種因素而造成切片的質(zhì)量低劣,，甚至完全失敗。現(xiàn)將切片時(shí)經(jīng)常遇到的一些缺點(diǎn),、可能的原因以及補(bǔ)救辦法列于表1-3,。 表1-3 石蠟切片可能產(chǎn)生的問題和解決方法 缺 點(diǎn)：石蠟帶彎曲不直 原 因： 1．石蠟塊上下兩邊不平行 2．石蠟塊的上下兩邊不和刀口平行 3．刀口鋒利不一，局部產(chǎn)生差異 4．蠟塊的一邊較另一邊為軟,，或兩邊的硬度不一致 5．材料未居蠟塊正中央 6．材料大而形不正 補(bǔ) 救 辦 法 ： 1．取下臺(tái)木,，將兩邊修干 2．調(diào)節(jié)標(biāo)本臺(tái)，使兩者平行 3．移動(dòng)刀片,，改用新的刀口 4．待蠟塊冷卻后再切,，或重新包埋 5．用刀片切去部分石蠟，使材料居中 6．在大的一邊切去少許石蠟 缺 點(diǎn)：切片分離,、不能連成帶狀 原 因： 1．室溫過低 2．石蠟過硬 3．材料邊緣留蠟太少 4．刀的角度不適合 補(bǔ) 救 辦 法 ： 1．在切片機(jī)上方開一電燈或提高室溫 2．在蠟塊面加一層45℃的軟蠟或用手指蠟?zāi)Σ翂K面 3．重新包埋 4．矯正刀的角度 缺 點(diǎn)：切片卷起呈圓筒狀 原 因： 1．室溫過低 2．石蠟過硬 3．刀口太鈍 4．刀的傾角太大 補(bǔ) 救 辦 法 ： 1．提高室溫 2．加軟蠟 3用毛筆將蠟片攤開壓住,，切2—3 片即成帶 4．減小傾角 缺 點(diǎn)：切片粘附于切片刀，皺摺在一起 原 因： 1．室溫過高 2．石蠟過軟 3．刀口上留有一層石蠟 4．刀口鈍 補(bǔ) 救 辦 法 ： 1．降低室溫 2．將蠟塊投入涼水中稍浸耒—增加 3．切片厚度,，改用硬蠟包埋,，用二甲苯拭去刀口的石蠟 4．磨刀或移動(dòng)刀口 缺 點(diǎn)：切片縱裂 原 因： 1．刀有缺口 2．石蠟塊中含有顆粒,、雜質(zhì) 3．刀口留有碎屑或細(xì)絲 4．組織太硬 補(bǔ) 救 辦 法 ： 1．可移動(dòng)刀口 2．將顆粒拽去 3．清潔刀口 4．讓包埋塊在水中浸泡 缺 點(diǎn)：切片有橫紋 原 因： 1．刀和臺(tái)木的固定螺絲太松 2．刀口傾斜度太大 3．刀口有石蠟屑 補(bǔ) 救 辦 法 ： 1．旋緊螺旋 2．可放平1—2,。后再切 3．用氯仿拭去 缺 點(diǎn)：切片厚薄不勻 原 因： 1．切片機(jī)有毛病 2．夾刀不當(dāng) 3，未旋緊標(biāo)本臺(tái)螺旋 4,。石蠟塊過硬 補(bǔ) 救 辦 法 ： 1．矯正切片機(jī)裝置 2．對(duì)癥治療 3．旋緊螺旋 4．將石蠟塊在水中浸泡 缺 點(diǎn)：每張切片厚薄不勻 原 因： 1．刀口震動(dòng),，是由于材料過硬 2．刀的傾角太大 補(bǔ) 救 辦 法 ： 1。在蠟塊表面涂一層火棉膠 2．減小傾角 缺 點(diǎn)：材料發(fā)生裂隙破碎或脫落 原 因： 1．脫水不干凈 2．有透明劑殘留 3．石蠟透入時(shí),，溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng) 4．由于脫水劑和透明劑的影響,，使組織變硬發(fā)脆 5．材料太硬或太粗 補(bǔ) 救 辦 法 ： 1．無(wú)法彌補(bǔ) 2．增加浸蠟時(shí)間，重新包埋 3．無(wú)法補(bǔ)救 4．用正丁醇,、叔丁醇和二氧六環(huán)等進(jìn)行脫水和透明 5．在蠟塊表面涂一薄層火棉膠溶液 缺 點(diǎn)：切片時(shí)發(fā)生沙沙聲 原 因： 1．組織塊過硬 2．包埋溫度過高 3,，材料內(nèi)留有結(jié)晶體 補(bǔ) 救 辦 法 ： 1．浸泡水中軟化 2．無(wú)法補(bǔ)救 3．無(wú)法補(bǔ)救 缺 點(diǎn)：石蠟塊將蠟帶抬起 原 因： 1．由于摩擦而產(chǎn)生靜電荷所致 2．石蠟塊上面附有石蠟碎屑 3．刀口上附有石蠟碎屑 補(bǔ) 救 辦 法 ： 1．提高室溫 2．用刀片將碎屑清除 3．用二甲苯或氧仿清除 7．貼片 切好的切片必須貼附于載玻片上才能作進(jìn)一步處理，但是切片常有細(xì)小的橫紋,，必須經(jīng)展平后才能貼附,，否則影響染色和觀察。 貼片一般有撈片法和燙板法,。 撈片法比較簡(jiǎn)單,，首先將切片分割開，投入到48℃的溫水浴中,，這時(shí)切片都浮在水面上,，由于表面張力的作用使切片自然展平，然后用涂有甘油蛋白溶液（將雞蛋一個(gè)打破入杯中,，去除蛋黃留下蛋白,，用筷子充分調(diào)打成雪花狀泡沫,，然后用雙層紗布過濾至容器中，加入等量的甘油,，混合,，最后加入百分之一體積的麝香草酚（thymol）作防腐用，可保存幾個(gè)月到一年,。）或5％明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片,，使切片貼附在載玻片的合適位置，于室溫下放置一晝夜后使其徹底干燥,。 燙板法,，是將涂有粘片劑的載玻片上涂上水，把已分割好的切片貼上去,，再置載玻片于35℃恒定的燙板上讓切片攤干,，并傾斜或用吸水紙吸去水分，最后將載玻片再度放燙板上晾干,。 要注意,，不管是使用撈片法還是燙板法，所用的載玻片必須潔凈,，不能有油污（檢驗(yàn)法：已涂有粘片劑的載玻片上滴加數(shù)滴蒸餾水,，若發(fā)現(xiàn)水不均勻分散而聚成滴狀，即表示載玻片不清潔,，有殘留油脂等物在上面）,；切片的光面應(yīng)朝下，否則染色過程中切片容易脫落,。 8．染色 組織切片是無(wú)色透明的,，必須進(jìn)行染色后才能觀察到各種微細(xì)結(jié)構(gòu)。染色方法很多,，但是染色劑往往是水溶液,，因此切片必須經(jīng)過脫蠟而再度復(fù)水。這方法即為脫水,、透明的逆過程,。由于切片十分菲薄，處理的時(shí)間大大減少,，一般每級(jí)停留約2～5min,。 染色是一個(gè)復(fù)雜的過程，兼有物理和化學(xué)作用,，對(duì)其中的機(jī)制目前了解得不很清楚,。研究細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)的重要組分都有很多現(xiàn)成的方法，例如顯示DNA的Feulgen反應(yīng)，顯示RNA的Brachet反應(yīng),，顯示多糖的PAS反應(yīng),，顯示蛋白質(zhì)的Millon反應(yīng)和顯示某些酶的鈣—鈷法等，可以根據(jù)不同的要求來選用,。 9．透明 染色后的切片須再次經(jīng)過脫水,、透明。標(biāo)本經(jīng)二甲苯透明后,，折射率改變,，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地顯示出來,。 10．封藏 封藏的目的是使制成的切片能夠永久保存,，封藏劑必須能與透明劑互溶，對(duì)染色無(wú)影響,，折射率近似玻璃和具有粘性的物質(zhì),，常用的封藏劑有加拿大樹膠和中性樹膠。 封片的方法是：將載玻片從二甲苯中吸出后,，吸去多余的二甲苯,，在標(biāo)本上的二甲苯尚未干透之前加一滴樹膠，仔細(xì)覆蓋上蓋玻片,，避免產(chǎn)生氣泡,，也不得拖動(dòng)蓋玻片，以免將標(biāo)本破壞,。樹膠量視蓋玻片大小而定,，勿使過多過少,。 貼上標(biāo)簽,，注明材料、染色法,，待封藏劑凝固后便成為一張成功的石蠟切片,。 |
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