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我買了一臺顯微鏡,，實驗室用的那種，三個目鏡,，三個物鏡,，還有一個電光源。這樣,，我就可以在家里做生物實驗了,。 買了些東東： 品名 單位 數(shù)量 單價 金額 載玻片 盒 2 5 10 蓋玻片 盒 1 3 3 刀片 包 1 5 5 刀柄 把 1 6 6 無水乙醇 瓶 1 7 7 鑷子(14cm) 把 2 4 8 玻片盒 個 1 5 5 滴甁 個 1 3 3 量筒100ml 個 1 7 7 燒杯250ml 個 1 4 4 液體石蠟 瓶 1 13 13 還查了做永久切片的方法： 1 、非切片法 即不用切片機,，不經(jīng)切片手續(xù)而制成切片的方法,，根據(jù)材料性質(zhì)的不同，有不同的處理方法,，該類方法操作簡單快捷,，其中鋪片法、封藏法可使原有組織結(jié)構(gòu)不被破壞,，涂片法,、壓片法彌補了用包埋、切片法所不可能觀察清楚的不足,，因此是顯微標(biāo)本制作的中常用的手段,。 1.1 涂片法 主要用于血液、精液、尿液,、痰液、微生物等不能切片成薄片的液態(tài)顆粒性材料,，可在載玻片上涂成單層細(xì)胞,，再經(jīng)固定，脫水,，染色等手段制成永久標(biāo)本,。 1.2 鋪片法 主要用于動、植物組織的表皮層觀察,，可活體取待觀察動,、植物組織，用尖鑷子撕去一層表皮,，迅速平鋪在載玻片上,。 如洋蔥表皮細(xì)胞的鋪片制備。 1.3 壓片法 一些較幼嫩,，柔軟的材料可將其置載玻片上,，用小解剖刀將其分散，加染料一滴,，再蓋上蓋玻片,，用拇指垂直用力擠壓，使組織散成一薄片,，再進行觀察,，如植物根尖觀察染色體，花粉粒觀察發(fā)育階段等,。 1.4 離析法 該方法是利用化學(xué)試劑使組織的細(xì)胞間質(zhì)溶解,，使細(xì)胞能分散成單個個體。經(jīng)染色,、脫水,、透明即可觀察其個體形態(tài)，適用于肌肉,、葉片,、莖等部位。 1.5 磨片 用于很堅硬的組織,，如骨和牙,。 2 、切片法 切片法是必須依靠手或切片機將組織切成薄片來進行觀察的方法,。為了能清晰地觀察到動,、植物的組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)，必須先經(jīng)過一系列步驟將組織內(nèi)滲入某些支持物質(zhì)，使組織變硬以利于切成薄片,，根據(jù)所用支持劑的種類不同,，可分為徒手切片法、石蠟切片法,、火棉膠切法,、冰凍切片法等類型，切成薄片后還需要去蠟,，染色,、脫水、透明等步驟,，將其制成永久標(biāo)本,。 下邊以石蠟切片為例，介紹顯微標(biāo)本制作方法,。 2.1 取材 根據(jù)不同的實驗?zāi)康?，選擇相應(yīng)的材料，材料要求新鮮,、準(zhǔn)確,、完整，材料要避免擠壓,、挫傷,、干枯。所采集材料應(yīng)立即放入固定劑,，并編號,，注明采集時間、地點,、名稱,、組織部位，所取組織塊要大小適當(dāng),，即要能說明問題,，又要考慮固定劑的穿透能力。一般組織學(xué)取材稍大,，細(xì)胞學(xué)取材稍小,，植物組織取材稍小，動物組織取材要稍大,。 動,、植物的任何組織部位，要制成切片,，首先用化學(xué)試劑將其固定,，固定的作用在于通過固定劑，在盡量短的時間內(nèi)使原生質(zhì)體停止生命活動，并如同生前一樣精細(xì)的保存其細(xì)胞結(jié)構(gòu),，同時易于后步驟的染色所以良好的固定劑應(yīng)該具備以下條件：迅速滲入組織殺死原生質(zhì)體,，在短時間內(nèi)，組織內(nèi)外完全固定,；盡可能避免使組織膨脹或收縮,，并且軟硬合適于切片；增加細(xì)胞內(nèi)含物的折光程度,，易于鑒別，同時增加媒染作用和染色能力,。固定液同時是防腐液,，使材料不致變質(zhì)。 2.3 脫水 脫水是用一種即能與水又能與透明液混合的液體來逐漸置換樣品中游離的水?，F(xiàn)采用的脫水劑一般是丙酮或乙醇來進行梯度脫水,，脫水的時間，可根據(jù)組織的類型,，大小而定,。 脫水的過程： 一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100% →100% 脫水應(yīng)逐步而不應(yīng)跨越太大的進行，否則將引起組織強烈的收縮或變形,，在經(jīng)無水乙醇處理時,，應(yīng)保證試劑的純度。 2.4 透明 透明是用一種即能與酒精又能與包埋介質(zhì)混合的液體來置換樣品中的酒精,，從而為最終的包埋創(chuàng)造一個有利的條件,。 現(xiàn)采用的透明劑一般是二甲苯、甲苯,、氯仿等,。 其過程為：1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯 二甲苯是使用最廣泛的一種透明劑，它具有滲透力強,，溶解石蠟量大,，又易揮發(fā)的優(yōu)點，其缺點是易使組織收縮,，變硬,，變脆，因此透明時間應(yīng)根據(jù)組織塊大小及質(zhì)地酌情而定,。 2.5 滲蠟 將完成透明步驟的組織塊浸入透明劑與石蠟混合液中,，不斷提高石蠟的比例，直至用石蠟完全置換了組織塊中的透明劑,，便于今后的包理與切片,。 石蠟有液態(tài)與固態(tài)二種，滲蠟要在恒定溫箱（60°c）中進行，以保證石蠟處于液態(tài)中,。 2.6 包理 組織塊經(jīng)石蠟滲透后,，其內(nèi)部間隙已完全被石蠟占據(jù)，此時還需要用同種硬度的石蠟包理成蠟塊以利于后邊的切片,，包理可用相同的器具,，也可折疊一牛皮紙盒。 將液態(tài)石蠟緩緩倒入紙盒中,，再用鑷子輕輕將浸好蠟的組織塊夾入紙盒,，淺埋在石蠟內(nèi)，待石蠟冷卻成固態(tài)即包埋完畢,。 至此,，一塊組織已完成前處理過程，可以切片,，前邊的步驟表明看來既無高深的理論,，又無復(fù)雜的技術(shù)，一切看似簡單,，但一步做不到都會造成整個制片的前功盡棄,。 2.7 切片 修塊：切片前需修整蠟塊，即將包埋好的一大塊蠟塊切開,，使每一小塊都含有一塊組織,，并將這組織周圍的石蠟切除，將組織修成一小塊蠟塊并粘在大小適宜的硬木塊上,，以便于固定在切片機上,。 貼片：一手持毛筆，一手轉(zhuǎn)動切片機,，切片的蠟片連成一長條蠟帶 切下的蠟帶放在一干凈黑紙上,，用小刀根據(jù)需要切成數(shù)段，分別貼在干凈載玻片上,。在恒溫展片臺上展平,、烘干。 2.8 染色 切片可用不同方法,，使其干燥,，然后進行染色。因為每一張載片上粘貼的是蠟帶,，因此必須先用二甲苯去除石蠟再用酒精去除二甲苯,，再進入水中，才能染色,，染色的方法很多,，要根據(jù)每張標(biāo)本要求顯示的目的選擇不同的染劑,，最常用的是蘇木精，伊紅染色蘇木精使細(xì)胞核是深紫色,，伊紅使細(xì)胞質(zhì)顯粉紅色,，以此顯示清晰的細(xì)胞形態(tài)和核的大小，位置,，染色后再根據(jù)制片的基本原理,，使帶水的載片經(jīng)歷脫水→透明步驟最后喲感樹膠封片 基本步驟如下：二甲苯×2（脫蠟）→酒精+二甲苯（1:1）→100%酒精×2→90% 酒精→80%→70%→50%→30%→水→蘇木精染色(鏡檢)→水→50%→70%→90%→0.5%伊紅(95%酒精配制)→95%→100%×2→二甲苯:酒精(1:1)→二甲苯×2→樹膠封片 簡便方法： 先將各種材料切成片，要薄,，不要用力的用鑷子夾,，放在載玻片上，在載玻片上滴一滴水,，將薄片放入,，如顏色十分淡，加碘酒染色,，蓋上蓋玻片，用紙巾將水吸干,，即可,。 石蠟切片： 石蠟切片（paraffin section） 組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中最為廣泛應(yīng)用的方法。石蠟切片不僅用于觀察正常細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu),，也是病理學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué)科用以研究,、觀察及判斷細(xì)胞組織的形態(tài)變化的主要方法，而且也已相當(dāng)廣泛地用于其他許多學(xué)科領(lǐng)域的研究中,。教學(xué)中,，光鏡下觀察切片標(biāo)本多數(shù)是石蠟切片法制備的?；畹募?xì)胞或組織多為無色透明,，各種組織間和細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間均缺乏反差，在一般光鏡下不易清楚區(qū)別出,；組織離開機體后很快就會死亡和產(chǎn)生組織腐敗,，失去原有正常結(jié)構(gòu)，因此,，組織要經(jīng)固定,、石蠟包埋、切片及染色等步驟以免細(xì)胞組織死亡,，而能清晰辨認(rèn)其形態(tài)結(jié)構(gòu),。 石蠟切片制作基本技術(shù) 石蠟切片法包括取材、固定,、洗滌和脫水,、透明,、浸蠟、包埋,、切片與粘片,、脫蠟、染色,、脫水,、透明、封片等步驟,。一般的組織從取材固定到封片制成玻片標(biāo)本需要數(shù)日,，但標(biāo)本可以長期保存使用，為永久性顯微玻片標(biāo)本,。 1.取材 應(yīng)根據(jù)要求選取材料來源及部位,。例如植物細(xì)胞有絲分裂多選取洋蔥根尖，細(xì)胞分裂快又便于切??；豬的肝小葉邊界清晰明確；耳蝸以豚鼠的內(nèi)耳易于定位和剝離,。材料必須新鮮,，擱置時間過久則產(chǎn)生蛋白質(zhì)分解變性，導(dǎo)致細(xì)胞自溶及細(xì)菌的滋生,，而不能反映組織活體時的形態(tài)結(jié)構(gòu),。 2.固定 用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)藥液--固定液浸漬切成小塊的新鮮材料，迅速凝固或沉淀細(xì)胞和組織中的物質(zhì)成分,、終止細(xì)胞的一切代謝過程,、防止細(xì)胞自溶或組織變化，盡可能保持其活體時的結(jié)構(gòu),。固定能使組織硬化,，有利于切片的進行，而且也有媒浸作用,，有利于組織著色,。固定液的種類很多，其對組織的硬化收縮程度以及組織內(nèi)蛋白質(zhì),、脂肪,、糖類等物質(zhì)的作用各不相同。例如純酒精可固定肝糖而能溶解脂肪,，甲醛能固定一般組織,，但溶解肝糖和色素。固定液可分為單一固定液及混合固定液,。前者有甲醛（蟻醛,、福爾馬林）,、酒精、醋酸或冰醋酸,、升汞,、鋨酸（四氧化鋨）、重鉻酸鉀及苦味酸等,，單一固定液不能固定細(xì)胞中的所有成分,；混合固定液可以互補不足，常用的混合固定液有Bouin氏液,、Zenker氏液,、FAA液、Carnoy氏液,、SuSa液（配方見有關(guān)技術(shù)書籍）,。因此，應(yīng)根據(jù)所要顯示的內(nèi)容來選擇適宜的固定液,。10％福爾馬林（4％甲醛）或10％磷酸緩沖福爾馬林是病理切片常規(guī)使用的固定液,，不僅適用于常規(guī)HE（蘇木精-伊紅）染色，還可以用于組織學(xué)有關(guān)的其他技術(shù)的切片染色,。固定液的用量通常為材料塊的20倍左右,，固定時間則根據(jù)材料塊的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以從1小時至數(shù)天,，通常為數(shù)小時至24小時。 3.洗滌與脫水 固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀,，否則會影響以后的染色效果,。多數(shù)用流水沖洗；使用含有苦味酸的固定液固定的則需用酒精多次浸洗,；如果組織經(jīng)酒精或酒精混合液固定,，則不必洗滌，可直接進行脫水,。固定后或洗滌后的組織內(nèi)充滿水分,，如不除去水分就無法進行以后的透明、浸蠟與包埋,，因為透明劑多數(shù)是苯類,，苯類和石蠟均不能與水相融合，水分不脫盡,，苯類不能浸入,。酒精為常用脫水劑，它既能與水相混合,，又能與透明劑相混,，為了減少組織材料的急劇收縮,，應(yīng)使用從低濃度到高濃度遞增的順序進行，通常從30％或50％酒精開始,，經(jīng)70％,、85％、95％直至純酒精（無水乙醇）,，每次時間為1～數(shù)小時,，如不能及時進行各級脫水，材料可以放在70％酒精中保存,，因高濃度酒精易使組織收縮硬化,，不宜處理過久。正丁醇,、叔丁醇,、丙酮及二氧陸環(huán)等也可做脫水劑。 4.透明 純酒精不能與石蠟相溶,，還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液,，替換出組織內(nèi)的酒精。材料塊在這類媒浸液中浸漬,，出現(xiàn)透明狀態(tài),，此液即稱透明劑，透明劑浸漬過程稱透明,。常用的透明劑有二甲苯,、苯、氯仿,、正丁醇等,，各種透明劑均是石蠟的溶劑。通常組織先經(jīng)純酒精和透明劑各半的混合液浸漬1～2小時,，再轉(zhuǎn)入純透明劑中浸漬,。透明劑的浸漬時間則要根據(jù)組織材料塊大小及屬于囊腔抑或?qū)嵸|(zhì)器官而定。如果透明時間過短,，則透明不徹底,，石蠟難于浸入組織；透明時間過長,，則組織硬化變脆,，就不易切出完整切片，最長為數(shù)小時,。 5.浸蠟與包埋 用石蠟取代透明劑,，使石蠟浸入組織而起支持作用。通常先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1～2小時,，再先后移入2個熔化的石蠟液中浸漬3小時左右,，浸蠟應(yīng)在高于石蠟熔點3℃左右的溫箱中進行,，以利石蠟浸入組織內(nèi)。浸蠟后的組織材料塊放在裝有蠟液的容器中（擺好在蠟中的位置）,，待蠟液表層凝固即迅速放入冷水中冷卻,，即做成含有組織塊的蠟塊。容器可用光亮且厚的紙折疊成紙盒或金屬包埋框盒,。如果包埋的組織塊數(shù)量多,，應(yīng)進行編號，以免差錯,。石蠟熔化后應(yīng)在蠟箱內(nèi)過濾后使用,，以免因含雜質(zhì)而影響切片質(zhì)量，且可能損傷切片刀,。通常石蠟采用熔點為56～58℃或60～62℃兩種,，可根據(jù)季節(jié)及操作環(huán)境溫度來選用。 6.切片 包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)整的四棱臺,，以少許熱蠟液將其底部迅速貼附于小木塊上,，夾在輪轉(zhuǎn)式切片機的蠟塊鉗內(nèi)，使蠟塊切面與切片刀刃平行,，旋緊,。切片刀的銳利與否、蠟塊硬度適當(dāng)都直接影響切片質(zhì)量,，可用熱水或冷水等方法適當(dāng)改變蠟塊硬度,。通常切片厚度為4～7微米，切出一片接一片的蠟帶,，用毛筆輕托輕放在紙上,。 7.貼片與烤片 用粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后的脫蠟,、水化及染色等步驟中二者滑脫開。粘附劑是蛋白甘油,。首先在潔凈的載玻片上涂抹薄層蛋白甘油,，再將一定長度蠟帶（連續(xù)切片）或用刀片斷開成單個蠟片于溫水（45℃左右）中展平后，撈至玻片上鋪正,，或直接滴兩滴蒸餾水于載玻片上,，再把蠟片放于水滴上，略加溫使蠟片鋪展,，最后用濾紙吸除多余水分,，將載玻片放入45℃溫箱中干燥，也可在37℃溫箱中干燥,，但需適當(dāng)延長時間,。 8.切片脫蠟及水化 干燥后的切片需脫蠟及水化才能在水溶性染液中進行染色,。用二甲苯脫蠟，再逐級經(jīng)純酒精及梯度酒精直至蒸餾水,。如果染料配制于酒精中,，則將切片移至與酒精近似濃度時，即可染色,。 9.染色 染色的目的是使細(xì)胞組織內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的顏色以便于觀察,。未經(jīng)染色的細(xì)胞組織其折光率相似，不易辨認(rèn),。經(jīng)染色可顯示細(xì)胞內(nèi)不同的細(xì)胞器及內(nèi)含物以及不同類型的細(xì)胞組織,。染色劑種類繁多，應(yīng)根據(jù)觀察要求及研究內(nèi)容采用不同的染色劑及染色方法,，還要注意選用適宜的固定劑才能取得滿意的結(jié)果,。經(jīng)典的蘇木精（Hematoxylin）和伊紅（曙紅，Eosin）染色法是組織學(xué)標(biāo)本及病理切片標(biāo)本的常規(guī)染色,，簡稱HE染色,。經(jīng)HE染色后，細(xì)胞核被蘇木精染成紫藍色,，多數(shù)細(xì)胞質(zhì)及非細(xì)胞成分被伊紅染成粉紅色,。由于蘇木精是帶陽離子的染料，染液呈堿性,，核內(nèi)染色質(zhì)及胞質(zhì)內(nèi)核糖體等物質(zhì)對這種染料有親和性,，稱嗜堿性；而帶陰離子的染料伊紅配制的染液呈酸性,，對這種染料的親和性,，稱嗜酸性。有時不同的組織結(jié)構(gòu)還需要用特殊的染料及染色方法加以顯示,，稱特殊染色,。有些細(xì)胞組織經(jīng)硝酸銀浸潤后，可使溶液中銀離子還原成金屬銀或銀粒附著在細(xì)胞組織上,，呈棕黑色,，這種性質(zhì)稱親銀性，而有些細(xì)胞組織本身不能使硝酸銀的銀離子還原成金屬銀,，還需加還原劑才能將銀離子還原,，稱嗜銀性。 10.切片脫水,、透明和封片 染色后的切片尚不能在顯微鏡下觀察,，需經(jīng)梯度酒精脫水，在95％及純酒精中的時間可適當(dāng)加長以保證脫水徹底；如染液為酒精配制,，則應(yīng)縮短在酒精中的時間,，以免脫色。二甲苯透明后,，迅速擦去材料周圍多余液體,，滴加適量（1～2滴）中性樹膠，再將潔凈蓋玻片傾斜放下,，以免出現(xiàn)氣泡,，封片后即制成永久性玻片標(biāo)本，在光鏡下可長期反復(fù)觀察,。注意有些染料需特定廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品,。根據(jù)各種染色方法、組織類別及切片厚度,，掌握適宜的染色時間,，才能達到較好的染色效果。 石蠟制片程序及環(huán)節(jié)繁多,，需數(shù)日才能完成1個周期,，但切片可長期保存，供教學(xué),、科研及病理診斷及復(fù)察,，并可利用蠟塊作其他項目的回顧性研究。病理常規(guī)制片過程中已簡化了一些細(xì)的環(huán)節(jié)或縮短了部分處理時間以適應(yīng)臨床需要（可縮短至2天）,。雖然冰凍切片大大快于石蠟切片,，但所顯示的形態(tài)結(jié)構(gòu)卻不如前者，因此病理醫(yī)生最后還需要根據(jù)石蠟切片作出準(zhǔn)確診斷,。近些年來,，在病理常規(guī)制片過程中采用了微波技術(shù)，從而大大縮短了制片過程,，而且對形態(tài)結(jié)構(gòu)并沒有影響,。微波是一種波長很短、頻率卻很高的高頻電磁波［波長為1米 ～1毫米,，頻率為300兆赫（MHz）～300千兆赫（GHz）］,。組織經(jīng)微波輻射后加速組織內(nèi)部分子的高速運動，以使液體的運輸加快,，增加彌散、滲透和交換效率,，從而加速組織的固定,、脫水、透明、包埋和染色各個環(huán)節(jié),。例如常規(guī)福爾馬林固定需數(shù)小時～1天,，而且能引起組織收縮及某些抗原成分不同程度的受到破壞，微波固定僅需1～2分鐘,，且可減少抗原的丟失和損害,。選擇適當(dāng)?shù)臋n次（功率）、輻射時間和溫度是極為重要的,。目前微波技術(shù)的應(yīng)用在國內(nèi)尚處于起步階段,，許多技術(shù)應(yīng)用環(huán)節(jié)尚需進一步摸索。 石蠟切片與其他技術(shù)方法的結(jié)合 石蠟切片不僅是經(jīng)典的方法,，又是最基本的方法,，它與其他新的技術(shù)方法相結(jié)合，使傳統(tǒng)的老技術(shù)擴大了應(yīng)用范圍,，開辟了許多新領(lǐng)域,，增加了許多新的研究、觀察內(nèi)容,。隨新的儀器及新的研究技術(shù)的不斷問世及使用,，使組織學(xué)的觀察研究從簡單的形態(tài)結(jié)構(gòu)深入到各種成分的定性觀察，又從定性轉(zhuǎn)向定量計測,，使細(xì)胞組織的形態(tài),，功能及代謝三結(jié)合，從而達到定性可靠,、定位準(zhǔn)確及定量可測,。 |
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