1.組織的取材

取材時(shí)要注意及時(shí)快速固定,，避免剪刀鑷子損傷組織,，組織要取全,。全盤考慮進(jìn)行病理切片的組織類型,，病變可能累及的部位,，組織包埋需要的剖面。

2. 組織的固定

在組織病理學(xué)中,，不管是組織切片乃至電鏡還是大體標(biāo)本的保存,，都必須進(jìn)行及時(shí)的適當(dāng)?shù)暮陀行У墓潭ā＝M織只有經(jīng)過固定,，才能完成隨后的一系列的制作,，直至切片的最后完成。

固定的作用：從組織學(xué)的角度其簡單的定義是,，保持細(xì)胞,、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，使之盡量保持細(xì)胞,、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu),，而從免疫組化技術(shù)的角度，固定的作用不僅是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固,，盡量減少或終止外源性酶和內(nèi)源性酶的反應(yīng),；防止細(xì)胞的自溶，以免使抗原擴(kuò)散至組織間質(zhì),；以保持組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu),；更重要的是保持組織或細(xì)胞的抗原性，不但要使抗原不導(dǎo)致失活,，而且不使抗原發(fā)生彌散的現(xiàn)象,，才能在免疫組化染色時(shí)，不產(chǎn)生過深的背景,，影響對陽性物的判斷,。

固定的目的

①能防止細(xì)菌的腐蝕和組織的自溶。細(xì)菌無處不存在,，它們隨時(shí)都可污染腐蝕未經(jīng)處理的組織,。固定液可以固定任何蛋白質(zhì)，凡有生命的東西,，都由蛋白質(zhì)組成,，蛋白質(zhì)被固定，生命就停止,，細(xì)菌也就失去了活力,。另者,，在日常生活中，人們?？膳龅竭@樣的問題,，一塊肉不經(jīng)處理放了幾天后就會變質(zhì)，這是為什么呢,？除了細(xì)菌參與外,，其本身也是很重要的。因?yàn)榻M織離體后,，供應(yīng)這此組織的血液隨之消失,，細(xì)胞缺氧，細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜的結(jié)構(gòu)受到破壞,，破壞后釋放出溶酶體酶,，日常生活中常碰到的肉變質(zhì)，就是細(xì)菌污染加組織自溶的結(jié)果,。

②保存細(xì)胞固有的物質(zhì),，能凝固或沉淀細(xì)胞內(nèi)或組織液，糖元等,，使細(xì)胞或組織基本上保持與生活時(shí)的物質(zhì)一樣,。細(xì)胞的固有物質(zhì)，即細(xì)胞核,、內(nèi)質(zhì)網(wǎng),、線粒體、高爾基器,、溶酶體,、過氧體，細(xì)胞骨架,，組織液,，抗原、糖元等,。這些物質(zhì),，如果不將其及時(shí)固定，是很容易喪失的,，尤其是溶酶體,，很容易受到破壞，因此應(yīng)特別小心,。

③使組織硬化,，便于切塊。剛離體的組織,，除了胃組織以外,，都是柔軟的組織,，尤其是胃腸道的組織，如果在沒有固定時(shí)就取材,，效果就很差,，不是取材不規(guī)整，就是厚薄不均,，粘膜和肌層很容易分開，因此,，要取得規(guī)整標(biāo)致的材料,，就必須將組織徹底固定，再行取材,。

④對某些具有傳染性的標(biāo)本,，能防止疾病的擴(kuò)散。病理標(biāo)本,、種類繁多,，成份復(fù)雜，各種病例都有,，具有傳染性的病種也不少,，如結(jié)核、肝炎,、麻風(fēng),、性病等等。對于此類標(biāo)本,，應(yīng)進(jìn)行徹底的固定后,，再行取材，如結(jié)核球,，固定時(shí)間應(yīng)在3-5天,。

⑤可增強(qiáng)染色的作用。組織經(jīng)過及時(shí)的固定,，最終可見到切片有鮮艷的染色,，而些時(shí)如果有一批未經(jīng)及時(shí)固定的組織，將看到最終的結(jié)果是,，核染色不清楚,，灰淡色，由此可得結(jié)論,，固定可以增強(qiáng)染色的作用,。

固定的注意事項(xiàng)：

①組織固定越新鮮越好。組織一經(jīng)離體,，就能及時(shí)地固定,，這是最好的,。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，如果要獲得某些酶的染色,，固定最好在組織離體后30秒至1分鐘,。對于其它達(dá)不到些要求是越快越好。原則上動(dòng)物死亡后半個(gè)小時(shí)內(nèi)取完并及時(shí)固定組織,。

②組織固定,，組織塊不宜過大。凡是需要固定的組織,，都不應(yīng)該太大太厚,，這是因?yàn)樗械墓潭ㄒ捍┩噶Σ粔驈?qiáng)，浸透度不夠快的緣故,。如果較大厚的組織,，不經(jīng)處理就進(jìn)行固定，那么待固定液進(jìn)入至中間對可能這些組織早就發(fā)生自溶了,。因此,，對于較大的組織，必須先進(jìn)行處理,，切成制片材料再行固定,，這是最佳的處理方法，如遇到胃腸的器官,，則應(yīng)將其剪開,，放平后，再行固定,，若非特急病例,，最好在固定后才取材，因這類組織,、粘膜和肌層容易分開,，沒固定時(shí)，難以取得最佳制片材料,，對于產(chǎn)酶類的器官如肝,、腎、脾等,，更要處理好,，否則更容易出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

③對不同類型的組織應(yīng)適當(dāng)合理地選擇固定液,。固定劑的種類繁多,，成份復(fù)雜，對組織的作用不盡相同。在我們的日常工作科研中,，對于組織的固定,，應(yīng)有針對性的選擇，方能獲得滿意的效果,。對于腎,，睪丸等泌尿系統(tǒng)和新生仔鼠應(yīng)選擇Bouin氏固定液。免疫組化可以選擇多聚甲醛和中性緩沖甲醛,；我病理室一般選擇中性緩沖甲醛,，它可以兼顧常規(guī)染色和免疫組織化學(xué)。

④組織固定,，時(shí)間不宜太短,，也不宜太長。固定時(shí)間應(yīng)根據(jù)取材大小,、性質(zhì)以及類型有關(guān)，視具體情況而定,；時(shí)間太短,，就不能很多的固定組織，因?yàn)椴还芙M織大小,，固定液浸入組織之中,，都需要有一定的時(shí)間，時(shí)間太短,，就會影響組織固定的效果,，對以后一系列關(guān)系的處理都有影響，切片質(zhì)量難以保證,，固定時(shí)間太長,，也不好。組織長時(shí)間的固定,，福爾馬林會產(chǎn)生一種酸,，影響核的染色。對于固定很長時(shí)間的陳列性標(biāo)本制片后切片染色不鮮艷,，顯得非常陳舊,。另外，長時(shí)間的固定往往會出現(xiàn)福爾馬林色素,，尤其是造血器官的標(biāo)本,，更應(yīng)注意。固定時(shí)間過長,，可降低抗原的活性,。一般小鼠組織固定24h即可。

⑤固定液的量要充分。固定液量的足夠與否決定著組織固定的成敗,。一般固定液和組織體積比為10：1~20：1之間,。

⑥特殊病例或特殊物質(zhì)應(yīng)選擇特殊的固定液。一般的病例標(biāo)本,，如沒特殊的要求,，都可以應(yīng)用甲醛配成的各種固定液來固定。但是,，如果要顯示狂犬病毒的包含體時(shí),，應(yīng)用上述的的固定液就不行了，必須采用丙酮來固定,，顯示糖元,，可選擇無水酒精或丙酮來固定組織。

3. 常規(guī)石蠟切片制片過程

組織經(jīng)系列酒精的脫水,，經(jīng)透明劑的作用,，經(jīng)熔化的石蠟的浸漬，包埋后所切成的切片稱為石蠟切片,。制片過程的每一步每一環(huán)節(jié)處理不好都會影響切片質(zhì)量,。

組織脫水：

把含于組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的水份用脫水劑把其置換出來的過程稱組織脫水。不管是正常的組織,，還是有病變的組織,，都含有不同程度量的水分。據(jù)測定,，人體的物質(zhì)組成約含水55~67%,，蛋白質(zhì)15~18%，脂類10~15%,，無機(jī)鹽3~4%及糖類1~2%[14],。如果不把這些水分脫去，石蠟切片將無法進(jìn)行,，因?yàn)槭灪退荒芑旌显谝黄?，所以除去組織中的水分成為制片中的關(guān)鍵，至今為止,，國內(nèi)常用的都是酒精,。因它不管在什么樣比例的情況下都能和水混合，所以它可以慢慢地將水從組織中置換出來,。酒精脫水力強(qiáng),，對組織又有硬化和易脆的不良影響。在使用時(shí),，通常是從低濃度至高濃度,，濃度系列通常是70%,、80%、90%,、95%和100%,，組織經(jīng)過這一系列處理后，基本可達(dá)到脫水的目的,。

每一步的組織脫水都需要控制好脫水時(shí)間,，一般根據(jù)組織塊大小和組織類型而定。短了脫水不干凈,，長了會使組織切片時(shí)易脆,。

組織的透明：

組織脫水后，要經(jīng)過一個(gè)浸蠟前的中間溶劑透明過程,；才能進(jìn)行浸蠟,。透明的目的：組織經(jīng)脫水后、浸蠟前必須經(jīng)過某些既能與脫水劑相混合又能溶解石蠟的中間溶劑處理,。組織在中間溶劑時(shí),，組織間隙內(nèi)存留的脫水劑完全為中間溶劑所取代時(shí)，組織就呈現(xiàn)透明狀態(tài),，此時(shí)即可進(jìn)行浸蠟,。透明液多采用二甲苯，組織經(jīng)無水乙醇脫水后轉(zhuǎn)入二甲苯透明,，組織的大小、厚薄不同,，透明時(shí)間也不同,。透明時(shí)間短了，透明不完全,，導(dǎo)致切不了片,，透明時(shí)間長了，透明過度,，導(dǎo)致切片易粉易碎,。

組織浸蠟： 　

用于浸蠟的石蠟最好是熔點(diǎn)稍低（56～58℃），低溫浸蠟對保存組織細(xì)胞內(nèi)的抗原免疫活性,，避免組織收縮和變硬變脆有幫助,，以盡量清除二甲苯蠟滲透到組織中起支撐作用，切片時(shí)才能把完整的組織和蠟一起完整切下來,。不同大小和厚薄的組織浸蠟時(shí)間有所不同,，一般為1～3小時(shí)。浸蠟溫度過高,，浸蠟時(shí)間過長或不夠均可導(dǎo)致組織收縮,，變硬變脆，難以切出理想切片。

組織包埋：　

組織經(jīng)浸蠟后即可進(jìn)行包埋,。包埋時(shí),，包埋石蠟的溫度要比組織高（約3~5℃），否則包埋冷凝后組織與包埋石蠟分離,，特別是在冷天包埋時(shí),，動(dòng)作更要迅速，否則容易導(dǎo)致組織與石蠟融合不好,，影響切片,。包埋時(shí)把組織最大最平切面或所需的病灶切面向下，對皮膚,、腸管和囊壁等層次清楚的組織其切面應(yīng)包含有各層組織,。組織包埋要選擇所需要的組織切面。

組織切片： 　

組織切片厚薄要適宜,，薄的切片細(xì)胞不會重疊,，易于觀察。切片的厚度應(yīng)為3～4μ,，組織蠟塊過硬,，切片刀或蠟塊沒固定好，會出現(xiàn)跳刀,、切片成一截厚一截薄的現(xiàn)象,。優(yōu)質(zhì)的組織切片要求切片較薄，平整,，無刀痕,，皺褶。切片太厚或呈波浪狀厚薄不勻,。

貼片烤片：

　 烤片時(shí)間短,，會造成染色時(shí)切片從載玻片上脫落或脫蠟不凈，染的切片會著色淺,、不上色或灰染,；烤片時(shí)間長，會造成對組織的損傷,。

染色：

染色染色的程度包括脫蠟,、浸水、染色,、分化,、促藍(lán)、脫水,、透明等過程,。切片經(jīng)過脫蠟至水,，HE染色后，要徹底脫水透明,，才能用中性樹膠封蓋,。如果脫水不徹底，封片后呈白色霧狀,，鏡下觀察模糊不清,，且容易褪色。要求組織結(jié)構(gòu)清晰,，色彩鮮艷,，細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)對比分明。

來源：網(wǎng)絡(luò)