1．取材

頸椎脫臼法處死小鼠,，打開腹腔,，剪取肝組織（或其他組織）。

切取的組織塊不宜太大,，以利于固定劑穿透,，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm為宜。取下所需要的肝組織,，切成一小塊2－3mm厚,。

注意事項(xiàng)：

（1）取材動(dòng)作要迅速，不宜拖太久,，以免組織細(xì)胞的成分,、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化。

（2）切片材料應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進(jìn)行選擇,，盡可能不要損傷所需要的部分,。

2．固定

將切好的肝組織用生理鹽水洗一下，立即投入中性福爾馬林固定液中固定30－50min,。

注意事項(xiàng)：

（1）一般固定液,，都以新配為好，配好后應(yīng)貯存在陰涼處,，不宜放在日光下,，以免引起化學(xué)變化，失去固定作用,。

（2）有些混合固定液的成分之間會(huì)發(fā)生氧化還原作用,，一定要在使用前混合，如果混合太早,，固定時(shí)就沒(méi)有作用了,。

（3）固定材料時(shí)，固定液必須充足,，一般為材料塊的20~30倍,，有些水分多的材料，中間應(yīng)更換1-2次新液,。

（4）材料固定完畢后,，保存于嚴(yán)密緊塞或加蓋的容器里，同時(shí)在容器外貼上標(biāo)簽,，并隨同材料在溶液中投入相應(yīng)的標(biāo)簽,，以免混淆。標(biāo)簽上注明固定液,、材料來(lái)源,、日期等,。標(biāo)簽上的文字，用黑色鉛筆寫,。

3.洗滌

材料經(jīng)固定后,流水沖洗,，數(shù)小時(shí)或過(guò)夜。

4.脫水

材料依次經(jīng)70%,、80%,、90%各級(jí)乙醇溶液脫水，各30min,，再放入95%,、100%各2次，每次20min,。

注意事項(xiàng)：

（1）脫水必須在有蓋的玻璃品中進(jìn)行,，防止吸收空氣中的水分。

（2）在更換高一級(jí)的脫水劑時(shí),，最好不要移動(dòng)材料以免損壞,，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液,，然后于皿中加入高一級(jí)脫水劑,。

（3）在低濃度酒精中，每級(jí)停留不宜太長(zhǎng),，否則易使組織變軟,，助長(zhǎng)材料的解體。

（4）在高濃度或純酒精中,，每級(jí)停留的時(shí)間也不宜太長(zhǎng),，否則會(huì)使組織變脆，影響切片,。

（5）如需過(guò)夜,，應(yīng)停留在70%酒精中。

（6）脫水必須徹底,，否則不易透明,，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象

5．透明

純酒精、二甲苯等量混合液15min,，二甲苯Ⅰ15min,、Ⅱ15min（至透明為止）,。

由于乙醇與石蠟不相溶,，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過(guò)二甲苯以過(guò)渡,。當(dāng)組織中全部被二甲苯占有時(shí),，光線可以透過(guò),，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。

透明注意事項(xiàng)

（1）使用透明劑時(shí),，要隨時(shí)蓋緊蓋子,，以免空氣中的水分進(jìn)入。

（2）更換每級(jí)透明劑,，動(dòng)作要迅速,，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣,。

（3）在透明過(guò)程中， 如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，說(shuō)明材料中的水未被脫凈,，應(yīng)退回純酒精中重新脫水,，然后再透明。

6．透蠟

放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min,，再放入石蠟Ⅰ,、石蠟Ⅱ透蠟各50-60分鐘。

透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等）,，使石蠟滲透到組織內(nèi)部達(dá)到飽和程度以便包埋,。透蠟時(shí)間根據(jù)組織大小而定。透蠟應(yīng)在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行,，并保持箱內(nèi)溫度在55-60℃左右,，注意溫度不要過(guò)高，以免組織發(fā)脆,。一般置于恒溫箱0.5h,。

透蠟注意事項(xiàng)

（1）盡量保持在較低溫度中進(jìn)行，以石蠟不凝固為度,；

（2）透蠟溫度要恒定,，不可忽高忽低；

（3）操作要迅速,，盡量在最短的時(shí)間內(nèi)完成石蠟透入過(guò)程,，以免引起組織變硬、變脆,、收縮等,。

7.包埋

包埋時(shí)，用鑷子夾取石蠟?zāi)Ｗ樱ń饘儋|(zhì)地）在酒精燈上稍加熱,，放在平的桌面上,，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入少許石蠟。再將鑷子在酒精燈上稍加熱,，夾取材料將切面朝下放入蠟?zāi)Ｖ?，排列整齊。再放上包埋盒,，輕輕倒入熔蠟,。

8.切片

①將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機(jī)的夾物臺(tái)上。

②將切片刀固定在刀夾上,，刀口向上,。

③搖動(dòng)推動(dòng)螺旋，使石蠟塊與刀口貼近,，但不可超過(guò)刀口,。

④調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右,。

⑤調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度,，一般為4-10微米。

⑥一切調(diào)整好后主可以開始切片,。此時(shí)右手搖動(dòng)轉(zhuǎn)輪,，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起,，搖轉(zhuǎn)速度不可太急,，通常以40-50r/min為宜。

⑦切成的蠟帶到20-30cm長(zhǎng)時(shí),，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起,，以免卷曲，并牽引成帶,，平放在蠟帶盒上,，靠刀面的一面較光滑，朝下,，較皺的一面朝上,。

⑧用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴,，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好,。

⑨切片工作結(jié)束后，應(yīng)將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟,，把切片機(jī)擦拭干凈妥為保存,。

9.展片、貼片

打開水浴鍋,，使水溫維持在40-45℃,，另準(zhǔn)備30%乙醇溶液,。

① 切片時(shí)，將一碗30%乙醇溶液放于切片機(jī)旁的桌面上,。

② 用小鑷子夾取預(yù)先用刀片割開的蠟帶，放在乙醇溶液的水面上,，使切片展開,。

③小鑷子輕輕地將連在一起的切片分開，用一個(gè)載玻片將切片完整,，已展開的切片撈至溫水中,，使之充分展開。

④ 另取潔凈的載玻片,，撈起展開的切片,，使其位于切片1/3處，另一端（磨邊,，粗糙的一端）磨面上標(biāo)記或貼上標(biāo)簽,，放于切片架上。

10.脫蠟復(fù)水

    將水浴鍋溫度調(diào)至60℃,，待水溫控制在60℃時(shí),，將切片連同切片架放入一干燥的染色缸內(nèi)，放入水浴鍋中,，蓋上蓋子（可密封）,，30min至蠟熔化。

之后,，石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ,、Ⅱ脫蠟各5min，然后放入100%,、95%,、90%、80%,、70%各級(jí)酒精溶液中各3-5min,，再放入蒸餾水中3min。

11.染色

切片放入蘇木精中染色約10-30min,。

染色時(shí)間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低,，適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)。室溫高時(shí)促進(jìn)染色,，染色時(shí)間可短些,，否則可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，冬季室溫低時(shí)可放入恒溫箱中染色,。

12.水洗

用自來(lái)水流水沖洗約15min,。使切片顏色變藍(lán)（或放入堿性水中也可）,，但要注意流水不能過(guò)大，以防切片脫落,。

13.分化

將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色,，約2秒至數(shù)十秒鐘。見(jiàn)切片變紅,，顏色較淺即可,。

14.漂洗

切片再放入自來(lái)水流水中使其恢復(fù)藍(lán)色。

15.脫水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3-5min,。

16.復(fù)染

用0.5%伊紅乙醇液對(duì)比染色1-3min,。

伊紅主要染細(xì)胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細(xì)胞核的濃淡相配合,，如果細(xì)胞核染色較濃,，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)濃染，以獲得鮮明的對(duì)比,。反之,，如果細(xì)胞核染色較淺，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)淡染,?？稍谝良t乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細(xì)胞質(zhì)容易著色,，并且經(jīng)乙醇脫水時(shí)不易褪色,。

17.脫水Ⅱ

將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無(wú)水乙醇中3-5min,。最后用吸水紙吸干多余的乙醇,。

18.透明

切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min,。

二甲苯應(yīng)盡量保持無(wú)水,，應(yīng)經(jīng)常更換，或用紗布包無(wú)水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分,。切片如在二甲苯中出現(xiàn)白霧現(xiàn)象,，說(shuō)明脫水未盡，應(yīng)退回乙醇中重新脫水,，否則切片難以鏡檢,。

19.封藏：中性樹膠封存

因切片經(jīng)二甲苯透明，使用中性樹膠作為封藏劑,，樹膠可用二甲苯稀釋至合適的稠度,。

封藏的方法：

封片前應(yīng)根據(jù)材料的大小，選用不同規(guī)格的蓋玻片,。材料透明后,，在桌上放一張潔凈的吸水紙,，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴樹膠（千萬(wàn)不能待二甲苯干燥后再進(jìn)行）,，用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側(cè),，稍為傾斜使其左側(cè)與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下,，這樣就可以減少或避免產(chǎn)生氣泡,。如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補(bǔ)足,。如膠液過(guò)多，可在干燥以后用刀刮去,，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠,。

染色結(jié)果：細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色,。

文章轉(zhuǎn)自英格恩生物技術(shù)博客,！