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Single cell genomic characterization reveals the cellular reprogramming of the gastric tumor microenvironment單細(xì)胞基因組特征揭示胃癌腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞重編程腫瘤微環(huán)境(TME)可以影響細(xì)胞狀態(tài)和功能,，不同TME對免疫治療產(chǎn)生截然不同的影響,。基于單細(xì)胞分辨率有利于識別腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和腫瘤間異質(zhì)性,，更好表征TME中不同細(xì)胞特點(diǎn),。因此，作者使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序手段對胃癌,，胃腸上皮化生,，配對正常組織和外周血樣本進(jìn)行分析，為篩選胃癌的潛在免疫治療標(biāo)志物和靶標(biāo)奠定理論基礎(chǔ),。1.1 樣本來源：胃癌(7)+胃腸上皮化生(1),；配對正常組織(8)+PMBCs(2)1.2 制作高質(zhì)量單細(xì)胞懸液：組織解離樣本+PBMC1.4 數(shù)據(jù)質(zhì)控和統(tǒng)計(jì)細(xì)胞：>200個(gè)基因,，線粒體基因占比<20％或UMI數(shù)量處于異常范圍2.1 標(biāo)準(zhǔn)化：NormalizeData (scale.factor = 10000)2.2 識別高可變基因：FindVariableGenes (x.low.cutoff = 0.0125,，x.high.cutoff = 6,y.cutoff = 0.5)2.3 消除批次效應(yīng)：ScaleData (nUMI)，例如通過設(shè)定UMI閾值以去除doublets (即兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞懸浮在一個(gè)液滴中)2.5 聚類分析：FindClusters (resolution = 0.8,；前20個(gè)PC)2.7 識別Cluster標(biāo)記的差異基因表達(dá)：FindAllMarkers/FindMarkers (至少25％的細(xì)胞中檢測到的基因,；使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；在Bonferroni校正后p<0.05時(shí),，log FC為0.25)2.8 合并數(shù)據(jù)集：在去除 (DoubletFinder) MergeSeurat2.9 可視化：DoHeatmap,；FeaturePlot；DimPlot,；DotPlot,；VlnPlot2.10 Sub-Cluster分析：SubsetData (do.clean=TURE)--->檢測可變基因--->使用UMI消除測序深度影響--->PCA分析--->聚類--->UMAP2.12 下游分析：差異分析；通路富集,；CellPhoneDB(推斷細(xì)胞之間相互作用),；CNV分析和可視化2.13 多重免疫熒光：驗(yàn)證組織中存在特定細(xì)胞(細(xì)胞標(biāo)志物陽性)1.胃癌與腸上皮化生隊(duì)列和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜作者從7例胃癌(GC）患者和1例腸道上皮化生(GIM)患者的手術(shù)切除或內(nèi)鏡活檢中獲得組織(包括配對正常組織，圖1A),。IHC顯示GC腫瘤具有腸道,，彌漫性或混合性特征(圖1B)?；?/span>scRNA-seq,，作者獲得了來自GC或GIM的32,407個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜，配對正常組織中18,657和PBMCs中5,103個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜,。為了確定基因表達(dá)的變化,，作者對每個(gè)單獨(dú)數(shù)據(jù)集采取了一系列分析步驟，包括數(shù)據(jù)質(zhì)控(QC)，主成分分析(PCA)和聚類,。作者采用統(tǒng)一流形逼近和投影(UMAP)來降維,，并可視化Cluster。使用Bonferroni校正后的p<0.05作為cut-off,，將差異表達(dá)基因(DEGs)鑒定為在Cluster中大于25％的細(xì)胞中表達(dá)且logFC大于0.25的基因,。作者將每個(gè)Cluster的DEGs與各種細(xì)胞類型已知標(biāo)記基因進(jìn)行了比較后對Cluster進(jìn)行定義：上皮細(xì)胞(表達(dá)PGC，TFF1,，MUC5AC,，EPCAM，GIF,，CHGA),，成纖維細(xì)胞(THY1，DCN,，COL4A1,，FAP)，內(nèi)皮細(xì)胞(PECAM,，ENG,，VWF，SELE),，免疫細(xì)胞(PTPRC),，[CD4+T細(xì)胞(CD3D，CD4,，IL7R),，細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD3D，CD8A,，CD8B),，Treg細(xì)胞(FOXP3，IL2RA),，NK細(xì)胞(NKG7,，GNLY)，B細(xì)胞(MS4A1),，漿細(xì)胞(免疫球蛋白基因),，肥大細(xì)胞(TPSAB1)和巨噬細(xì)胞(CD68，CD14,，FCGR3A),。此外，分析不同細(xì)胞中特異基因有助于識別doublets (圖1C,，D),。2.合并數(shù)據(jù)集并聯(lián)合分析為了識別所有樣本和患者之間的相似和差異性,，作者將GC，GIM,，配對正常組織和PBMCs 的scRNA-Seq數(shù)據(jù)匯總到一個(gè)數(shù)據(jù)集中,，并基于文庫制備和測序深度消除批次效應(yīng)。聚類分析后確定了40種不同的簇,，這些簇對多種特異性細(xì)胞類型,，包括上皮，基質(zhì)(成纖維細(xì)胞,，內(nèi)皮細(xì)胞),，淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞,，并在所有患者樣品中均發(fā)現(xiàn)(圖1E),。此外，每種細(xì)胞類型都有多種不同的轉(zhuǎn)錄狀態(tài),。為了進(jìn)行其他表征,，作者匯總了樣本中每種細(xì)胞類型的數(shù)據(jù)，并進(jìn)行了聚類分析,。 
作者識別出腫瘤,，化生和正常上皮細(xì)胞之間的差異,，源自不同患者的腫瘤上皮細(xì)胞間差異以及單個(gè)腫瘤內(nèi)的亞克隆異質(zhì)性。從綜合數(shù)據(jù)集中對上皮細(xì)胞進(jìn)行重新聚類分析,，發(fā)現(xiàn)了三個(gè)亞類。第一個(gè)亞類由正常胃上皮細(xì)胞組成-超過80％來自正常胃樣品(normal,；圖2A,，B，C),。第二個(gè)亞類由腫瘤特異性上皮細(xì)胞組成(GC 1型),，這些細(xì)胞中約有98％來自腫瘤樣本。值得注意的是,，GC 1型組中的每個(gè)簇在一名患者占主導(dǎo)地位–這表明GC腫瘤間存在異質(zhì)性,，同樣提示每個(gè)腫瘤都具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特性。第三類涉及源自GC上皮細(xì)胞以及正常組織(GC 2型),，包含來自P6649患者約58％具有胃上皮化生但沒有GC的細(xì)胞,，這些細(xì)胞可能代表具有與腫瘤上皮和化生上皮重疊的轉(zhuǎn)錄特征。為了對胃癌與正常上皮細(xì)胞的高精度分類,，作者采用scPred基于轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)對腫瘤和正常組織的上皮細(xì)胞進(jìn)行分類,，結(jié)合分解基因表達(dá)矩陣的方差結(jié)構(gòu)來識別有限的信息特征，并使用機(jī)器學(xué)習(xí)方法來估計(jì)這些特征對細(xì)胞分類的影響。結(jié)果表明scPred和Seurat的分析結(jié)果相一致(圖2D),。使用scRNA-seq,，可以通過分別分析基因表達(dá)的相應(yīng)增加或減少來檢測染色體水平的擴(kuò)增或缺失。為了識別腫瘤和正常上皮的CNV差異,，作者將每個(gè)患者的normal與GC 1型或GC 2型組進(jìn)行了比較(圖2E),。在P6207患者的GC 1型，7p,，7q,，8q和9q中檢測到CNV擴(kuò)增，而在10p中出現(xiàn)CNV缺失,。P6342患者的腫瘤出現(xiàn)20q的CNV擴(kuò)增和4q的CNV缺失,。對于具有化生和P6592的患者P6649，樣品僅包含少量細(xì)胞,，其拷貝數(shù)變化明顯,。這些CNA結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了GC數(shù)據(jù)集中正常和腫瘤上皮細(xì)胞之間的區(qū)別。5.腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和腫瘤間異質(zhì)性作者分析了不同患者的GC 1型和GC 2型細(xì)胞的各種致癌通路,。圖2F顯示激活水平的顯著差異,，證實(shí)了腫瘤間轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性。有趣的是,，這些激活程度并未根據(jù)MSI和MSS分子亞型之間的差異進(jìn)行聚類,。個(gè)別患者的腫瘤包含GC 1型和GC 2型細(xì)胞的多個(gè)簇，表明腫瘤內(nèi)異質(zhì)性,。通路分析將每個(gè)患者的腫瘤將這些簇分為三到五個(gè)亞群,，從而確認(rèn)了亞克隆結(jié)構(gòu)(圖2G)。例如,，P6207中的異質(zhì)性以細(xì)胞周期,，KRAS通路，WNT激活的差異為特征(圖2G),?；谶@些結(jié)果，作者假設(shè)這些亞群可能為腫瘤提供明顯的生長優(yōu)勢,。
圖2.上皮細(xì)胞間轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性6.TME重編程導(dǎo)致除M1和M2之外的巨噬細(xì)胞狀態(tài)與正常胃組織相比,，腫瘤免疫微環(huán)境(TME)中巨噬細(xì)胞具有明顯的基因表達(dá)變化。巨噬細(xì)胞分為M1或M2型,，具有抗腫瘤和促腫瘤作用,。然而，作者觀察到巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)特征不符合M1或M2型,。作者在所有患者中檢測到了11個(gè)不同的簇,，觀察到了髓系譜系細(xì)胞的各種亞類(圖3A-D),。九個(gè)單核巨噬細(xì)胞簇由CD14，FCGR3A,，CD68的標(biāo)記基因表達(dá)定義,；兩個(gè)樹突狀細(xì)胞(DC)簇由CLEC4C，ID2,，IRF4和CD83的標(biāo)記基因表達(dá)定義(圖3C),。值得注意的是，與正常胃組織相比,，巨噬細(xì)胞在腫瘤中明顯富集(圖3E),。作者檢查了巨噬細(xì)胞簇中M1(CCL19，TNF,，CCL5)和M2(MRC1,，CCL18，CCL13,，CD163)型標(biāo)志基因的表達(dá)(圖3F),。M1/M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志基因均不能分群。而且,，這些基因在同一簇中共表達(dá),，這表明轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性獨(dú)立于 M1/M2型巨噬細(xì)胞。圖3G表明轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性與HSP家族基因,，THBS1,，趨化因子(CCL20，CCL18,，CCL3),，MMP9，補(bǔ)體家族和細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)差異有關(guān),。PBMC中的單核細(xì)胞與腫瘤或正常組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)分離,，表明具有轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性(圖3B，D),。作者對組織中的巨噬細(xì)胞和PBMC中的單核細(xì)胞進(jìn)行軌跡推斷(圖3H)。單核細(xì)胞以單個(gè)軌跡狀態(tài)存在,，大多數(shù)組織巨噬細(xì)胞沿兩個(gè)不同狀態(tài)分化,。這表明浸潤腫瘤的巨噬細(xì)胞不同于單核細(xì)胞，但與正常組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞保留了一些基本的相似性,。DC可分為2種亞群,，其中一個(gè)具有漿細(xì)胞樣DC的標(biāo)志基因，如IL3RA(CD123)和CLEC4C(CD303)–該亞類主要在PBMC中檢測到(圖3C,，圖3D),。另一種具有活化DC的標(biāo)志基因,，如CD83，CCR7,，IL7R和ID2以上結(jié)果提示即巨噬細(xì)胞存在于由一組特定基因而非M1/M2型巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)功能狀態(tài),。
7.TME中耗竭T細(xì)胞具有高CXCL13表達(dá)和增殖特點(diǎn)細(xì)胞毒性CD8+T淋巴細(xì)胞(CTL)分布在五個(gè)不同簇中，檢查了每個(gè)簇的主要來源(配對正常組織,，腫瘤組織或PBMCs),，未致敏(naive)標(biāo)志基因(CCR7，SELL),，組織效應(yīng)記憶標(biāo)志基因(CD69,，ITGAE，ITGA1)和細(xì)胞毒性標(biāo)志基因(GZMB,，GZMA,，PRF1，IFNG,， NKG7)(圖4A,，B)。CTLs的亞組可分為腫瘤naive CTLs(簇0),，正常效應(yīng)CTL(簇1),，PBMC效應(yīng)CTL(簇19)和腫瘤效應(yīng)CTL(簇6、22),。在TME中,，具有耗竭T細(xì)胞(TEx)的2個(gè)CTL亞組(簇6和22)在具有低表達(dá)水平PRF1和IFNG（顆粒酶）圖4B。此外,，TEx的2個(gè)CTL亞組(簇6和22)表達(dá)了多個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因(PDCD1,，TIGIT，CD96,，HAVCR2（TIM3）,，LAG3，CTLA4,，VSIR),；這些免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)水平作為衡量免疫抑制程度的指標(biāo)。此外,，這些細(xì)胞還表達(dá)了多種共刺激分子(ICOS,，TNFRSF18（GITR），CD27,，TNFRSF9,，CD40，CD226,，TNFRSF4)(圖4B),。圖4C顯示TEx的2個(gè)CTL亞組(簇6和22)具有低細(xì)胞毒性,，高耗竭和高增殖表型(簇22)。簇6則顯示出具有較低的耗竭和增殖能力,，并且CXCL13的表達(dá)明顯較高,。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，作者通過多重免疫熒光染色(圖4D),，在所有樣品中檢測到了這些細(xì)胞譜系,，如效應(yīng)T細(xì)胞(CD45RO，CD3陽性),，耗竭型T細(xì)胞(PD-1,，CD45RO，CD3陽性),。
圖4. 細(xì)胞毒性T細(xì)胞間轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性8.成纖維細(xì)胞,，周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的TME重編程作者對所有樣本中的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行聚類分析和注釋，確定了成纖維細(xì)胞(THY1,，DCN,，COL4A1，FAP),，內(nèi)皮細(xì)胞(PECAM,，ENG，VWF,，SELE)和周細(xì)胞(RSG5,，PDGFRB)(圖5A，5C),。與正常細(xì)胞相比,，所有三種細(xì)胞均富集在腫瘤組織中(圖5B，5D),。為了確定正常與腫瘤組織中基質(zhì)細(xì)胞的表型差異,，腫瘤特異性成纖維細(xì)胞，周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)了多種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)核心相關(guān)成分(圖5E),。腫瘤或正常組織的基質(zhì)細(xì)胞具有明顯不同的調(diào)節(jié)基因或調(diào)節(jié)子,。例如，腫瘤特異性內(nèi)皮細(xì)胞具有更高活性的SOX18和SOX7(已知的多種內(nèi)皮細(xì)胞的的調(diào)節(jié)基因),。此外,。腫瘤特異性成纖維細(xì)胞中具有高活性的EGR2基因(影響纖維化)。以上結(jié)果區(qū)分了基質(zhì)細(xì)胞在基因表達(dá)程序及其調(diào)控因子上的差異,。
圖5.基質(zhì)細(xì)胞間轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性9.TME中細(xì)胞通訊可能影響細(xì)胞狀態(tài)作者發(fā)現(xiàn)TME的細(xì)胞間通信網(wǎng)絡(luò)可能會影響細(xì)胞狀態(tài)。首先,，基于CellPhoneDB進(jìn)行了無偏向的配體-受體相互作用分析,，推斷細(xì)胞之間相互作用(圖6A),。結(jié)果顯示基質(zhì)細(xì)胞是最核心的相互作用細(xì)胞之一，基質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞之間的細(xì)胞通訊是通過各種整合素受體與膠原蛋白,，纖連蛋白和THBS1配體的相互作用(圖6B),。成纖維細(xì)胞是WNT配體的重要來源，而在腫瘤上皮,，內(nèi)皮細(xì)胞,，成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞上表達(dá)相應(yīng)的受體。LGR4-RSPO3相互作用可能調(diào)節(jié)干性(圖6C)進(jìn)一步驗(yàn)證了作者先前研究中RSPO3源于胃癌的成纖維細(xì)胞,。自分泌和旁分泌Notch信號是血管生成的已知調(diào)節(jié)劑,，Notch信號傳導(dǎo)的相互作用在內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中也很重要(圖6D)。血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞上的血管生成受體KDR,，FLT1,，FLT4，PDGFB,，TEK與各自的配體具有明顯相互作用(圖6E),。相互作用組中有19種細(xì)胞因子，包括趨化因子,，白介素,，腫瘤壞死因子(TNF)及其相應(yīng)的受體，這些細(xì)胞因子可影響免疫細(xì)胞的狀態(tài),。 
圖6. TME中細(xì)胞-受體配體互作網(wǎng)絡(luò)到這里文章的主要內(nèi)容就介紹完了,，作者利用單細(xì)胞測序?qū)ξ赴┑?/span>TME進(jìn)行了詳細(xì)的分析，并鑒定出腫瘤內(nèi)和腫瘤間同一種類型細(xì)胞的異質(zhì)性,。例如巨噬細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性(不依賴于M1和M2型巨噬細(xì)胞),；細(xì)胞毒性T細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性(具有腫瘤耗竭T細(xì)胞型亞組的轉(zhuǎn)錄學(xué)特點(diǎn))。此外,，聯(lián)合單細(xì)胞測序和配體受體互作分析,，表征了TME專有的細(xì)胞間通訊。文章中單細(xì)胞測序的常規(guī)分析方法主要為質(zhì)控,，標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化,，降維，聚類,，尋找差異基因,，譜系分析(軌跡推斷)；但后續(xù)分析值得我們學(xué)習(xí),，如聯(lián)合CellPhoneDB推斷細(xì)胞間受體和配體的互作,；聯(lián)合拷貝數(shù)變異分析；對Cluster進(jìn)一步分類(Sub-Cluster)等,。
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