包埋劑embedding agent

　　在制作切片或超薄切片時(shí),，由于組織是柔軟的，或局部的軟硬不均,，這樣制作厚薄均勻的切片是困難的,。所以有必要用一定物質(zhì)浸透組織內(nèi)部，整個(gè)組織一樣硬化,，以利于切成薄片,，這種物質(zhì)叫做包埋劑,。一股用光學(xué)顯微鏡觀察的切片，用石蠟,、火棉膠,、炭蠟、明膠等作包埋劑,；電子顯微鏡則用環(huán)氧樹脂,、聚苯乙烯樹脂、異丁烯樹脂及水溶性樹脂,。

石蠟制片法是將材料經(jīng)固定,、脫水、透明,、浸蠟后包埋在石蠟里面進(jìn)行切片的方法,。此法適用范圍，制片手段完備,，能將材料切成極薄的片子（可切至2-8微米左右）,，并能制成連續(xù)的片子，這是其它制片法難以達(dá)到的,，因此在光學(xué)顯微鏡的制片技術(shù)上它是最常用的一種方法,。除了一些經(jīng)不住石蠟切片法中所應(yīng)用的各種藥劑處理的材料不能應(yīng)用石蠟切片以外，一般的材料都可以用此法制片,，但有制作時(shí)間較長(zhǎng),，操作過程復(fù)雜以及材料易發(fā)硬或發(fā)脆等缺點(diǎn)。該法多采用旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)進(jìn)行切片,。

石蠟制片操作程序如下：
（一）材料的采集與分割
采集材料應(yīng)根據(jù)制片的目的和要求而定,，材料要有代表性，無病蟲害或其它損傷,，如要觀察病理解剖,，則要取病斑、病癥部位,。采下的材料應(yīng)立即放在標(biāo)本箱或濕布包起來帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分割固定（如有條件也可在試驗(yàn)地采集后進(jìn)行分割固定）,。為使固定液能迅速的滲透材料，材料要進(jìn)行分割,。分割時(shí)動(dòng)作要迅速,，以防材料萎蔫。分割塊的大小,，宜小不宜大,，一般不超過1cm3，分割后立即殺死固定。

（二）殺死與固定
利用藥劑迅速把細(xì)胞殺死,，以保持材料本來的狀態(tài)和結(jié)構(gòu),。
常用的固定有F.A.A固定液、卡諾固定液等,。將固定液放在具塞小瓶中,，投入材料，蓋好瓶蓋,。用F.A.A固定液固定,，時(shí)間至少24小時(shí)。F.A.A固定液既是良好的固定劑,，也是保存劑,，因此材料可長(zhǎng)期保存在固定液中備用?？ㄖZ固定液穿透力強(qiáng),，固定較小材料一般1~6小時(shí)即可，最多不超過24小時(shí),。因卡諾固定液不能做保存劑,，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗,，每級(jí)約20min.,，然后保存在70%的酒精中備用。

（三）脫水
脫水的目的是除去組織中的水分,，便于透明,、浸蠟、包埋等步驟的進(jìn)行,，因?yàn)檫@些程序中所用的藥品都不能與水混合,，所以必須脫水,。常用的脫水劑為酒精,。脫水過程應(yīng)緩慢進(jìn)行，不能操之過急或時(shí)間過長(zhǎng),，以免組織變硬變脆或發(fā)生收縮現(xiàn)象,。脫水采用等級(jí)脫水（系列脫水），即從較低濃度酒精開始,，逐漸替換到高濃度酒精,。一般為：50%→70%→80%→95%（此時(shí)可加少許番紅，使組織著色便于包埋時(shí)定位）→無水酒精（兩次）,，每級(jí)停留時(shí)間2~4小時(shí)或更長(zhǎng)（無水酒精中時(shí)間宜短）,。
用 95%酒精配制各濃度酒精的方法：設(shè)原有酒精濃度為A，所需配制酒精濃度為B，則取Bml原有酒精,，加上A-Bml蒸餾水,，即可獲得Aml的B%的究竟。例如：95%酒精配成70%的酒精,，則取70ml的95%酒精,，加上25ml蒸餾水，則配成了95ml的70%的酒精,。

（四）透明
透明的目的是將脫水劑從材料中除去,，使材料透明，增記折光系數(shù),；同時(shí)便于下步的浸蠟和包埋等程序（因?yàn)榫烤共荒苋芙馐灒?。透明劑是一種既能與脫水劑混合，又能與包埋劑混合的藥劑,。常用的透明劑為二甲苯和氯仿,，適用原則也是逐級(jí)進(jìn)行，可減少材料收縮,。一般步驟是：2/3純酒精+1/3二甲苯→1/2純酒精+1/2二甲苯→1/3純酒精+2/3二甲苯→二甲苯（兩次）,，每級(jí)停留時(shí)間0.5~2小時(shí)或更長(zhǎng)些。二甲苯穿透能力強(qiáng),，但又宜使材料收縮變脆,，使用時(shí)不能在其中停留時(shí)間過長(zhǎng)。若材料放入二甲苯中時(shí)有白色混濁現(xiàn)象發(fā)生,，說明材料脫水不徹底,，應(yīng)把材料退回至純酒精中再行脫水。

（五）浸蠟
浸蠟的目的是逐漸除去透明劑,并為包埋劑所代替,。常用的包埋劑是石蠟,。浸蠟過程是使石蠟慢慢溶于浸有材料的透明劑中，溶解在透明劑中的石蠟漸漸深入到材料的細(xì)胞中去,，最后使透明劑完全被石蠟取代,，以便切片。
一般所用的石蠟分軟蠟（熔點(diǎn)40℃ 以下）和硬蠟（熔點(diǎn)40℃以上）,。浸蠟過程一般是從低溫到高溫,、從低熔點(diǎn)到高熔點(diǎn)逐漸進(jìn)行，這一過程不能操之過急,，否則浸蠟不徹底影響切片,。此外，軟材料可用熔點(diǎn)較低石蠟,，較硬的材料可用熔點(diǎn)較高的石蠟,；冬季可用熔點(diǎn)較低的石蠟,，夏季可用熔點(diǎn)較高的石蠟。石蠟必須純凈,，不含雜質(zhì),。整個(gè)浸蠟過程需在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行（按需要調(diào)整溫度）。材料最后一次二甲苯透明后即可浸蠟,，浸蠟過程中逐漸使二甲苯揮發(fā),，并不斷加入純石蠟，直至石蠟飽和為止,。浸蠟時(shí)間大約1~2天,。

（六）包埋（埋蠟、沉床）
材料浸蠟后再換兩次已熔融的純蠟,，然后將材料和石蠟一起倒入提前疊好的包埋紙盒中,，用加熱的鑷子迅速將材料按一定的間隔和所需的切面擺放整齊，同時(shí)用加熱的鑷子趕走材料周圍的氣泡,，待紙盒表面的石蠟?zāi)毯髮⒓埡衅椒湃肜渌?，使石蠟迅速凝固。最后從紙盒中取出蠟塊,，以便保存,。注意將樣品編號(hào)封于蠟塊上，以免樣品混淆,。

（七）修塊
將已包埋好的蠟塊切成小塊,，每一小塊包含一塊材料。然后按照所需的切面,，用單面刀片將小蠟塊切成梯形,，并可粗視到材料切面。然后用燒紅的蠟鏟把蠟塊底部牢固的粘接在載蠟器上,。

（八）切片
用切片機(jī)（如旋轉(zhuǎn)切片機(jī)）將蠟塊切成連續(xù)的蠟帶,。切片時(shí)先把切片刀夾在刀架上，再把載蠟器夾在固定裝置上（注意安裝切刀的角度,，刀口運(yùn)行方向與材料切面平行）,，然后調(diào)整好所需厚度，一般可在7~14微米,，視材料和所需觀察對(duì)象而定,，一般葉片,、芽可厚些,，胚囊和花粉粒可薄些,，轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)切片,。

（九）粘片
切下來的切片經(jīng)過鏡檢（根據(jù)情況也可不檢）,，將符合要求的切片粘在潔凈的載玻片上。粘片時(shí)先在載玻片上滴上一小滴粘片劑（可用蛋青和甘油各50ml,，加1g 水楊酸混合而成）,，加幾滴蒸餾水，然后用鑷子小心把切片放在水上,，在35-40℃下,，用撥針將切片伸直、展平,，傾斜載片,，使水流去并烘干。

（十）脫蠟,、染色,、脫水透明和封片
粘片后要經(jīng)過脫蠟、染色,、再次脫水透明,，然后封片永久保存。下面以植物生物學(xué)中觀察組織結(jié)構(gòu)最常用的番紅-固綠染色法說明脫蠟,、染色,、脫水透明和封片的過程：
二甲苯 →二甲苯（每次均10~15min.）→1/3純酒精+2/3二甲苯（1~2min.）→1/2純酒精+1/2二甲苯（1~2min.）→2/3純酒精+1/3二甲苯（1~2min.）→純酒精兩次（每次1~2min.）→95%、85%,、70%,、50%梯度酒精復(fù)水（每級(jí)1~2min.或更長(zhǎng)）→用 1%番紅配50%酒精染色1小時(shí)→50%、70%,、85%,、95%梯度酒精脫水（每級(jí)1~2min.或更長(zhǎng)）→用0.1%固綠配95%酒精復(fù)染2~5秒 →95%酒精脫水1~2分鐘→純酒精兩次（每次1~2min.）→2/3純酒精+1/3二甲苯透明（1~2min.）→1/2純酒精+1/2二甲苯透明（1~2min.）→1/3純酒精+2/3二甲苯透明（1~2min.）→二甲苯 →二甲苯（每次均10~15min.）→加拿大樹膠封片→貼標(biāo)簽鏡檢及保存。

組織石蠟包埋和切片技術(shù)

1,、切取組織,，浸泡在4％用pH7.4 BS配成的甲醛固定劑中，室溫24小時(shí),。

附：4％甲醛固定劑（5ml）：4.5ml 1×PBS(pH7.4)+0.5ml甲醛
2,、倒掉甲醛固定劑，加pH7.4 BS,每隔8小時(shí)更換一次,，4℃保存,，換液共3天。
3,、打開烘箱,，調(diào)溫至62℃，融石蠟,。
4,、酒精梯度脫水（30％,、50％、70％,、80％,、90％、95%,、100％×2）,，隔30分鐘更換一次。
5,、50％酒精＋50％二甲苯30分鐘（過渡步驟）,。
6、100％二甲苯,，時(shí)刻觀察組織塊至透明,。
7、放入烘箱中已經(jīng)預(yù)融的50％石蠟＋50％二甲苯中,，30分鐘,。
8、100％石蠟兩遍,，每次2小時(shí),。(若石蠟浸潤(rùn)不夠，仍有二甲苯,，則包埋后的石蠟塊較脆,，易分層、斷裂,。)
9,、100％石蠟紙盒內(nèi)凝固（先用蠟打底，再放入組織塊,，澆上蠟包埋,，放入4℃冰箱或水中冷凝，標(biāo)明組織塊放入方向）,，4℃存放備用,。
10、修塊,。
11,、融化石蠟?zāi)ㄓ趬K底，貼在木塊上,，壓實(shí),。
12、切片（5－10μm）,將切片平展于平板上,，光面朝上,。
13,、將光面朝下,，將石蠟薄切片放于水面上（水溫40℃）,，使其伸展。（時(shí)間勿太長(zhǎng)）
14,、將石蠟薄片貼在預(yù)先處理好的玻片上,。
15、40℃烘烤過夜,。

附：玻片的處理
切片前對(duì)洗凈的載玻片用粘附劑進(jìn)行處理是防止免疫組化過程中組織掉片的關(guān)鍵：洗凈的載玻片于1:50丙酮稀釋的APES中浸泡10～30s,，取出后再放入純丙酮中10～20s，涮去未與載玻片結(jié)合的APES,，取出晾干備用,。