外顯子組測序的常見問題（含有對照選擇）

勤悅軒 2021-07-18

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外顯子測序適用于什么種類的研究,？

在人類基因中大約有180,000個外顯子，外顯子CDS區(qū)大小占人類基因組的1～2%,，約30 Mb,。人類基因組的蛋白編碼區(qū)大約包含85%的致病突變。外顯子組測序主要是針對編碼區(qū)進行檢測,，所以外顯子組測序主要適用于編碼區(qū)潛在變異引起的疾病研究,。測序性價比高，尤其適合高深度,、大樣本量的測序,，可找出常見突變及低頻突變。主要應(yīng)用在孟德爾遺傳病及腫瘤等復(fù)雜疾病的研究,。

外顯子測序可以檢測哪些類型的變異,？

外顯子捕獲是一個雜交捕獲的過程，探針與不同外顯子區(qū)段的雜交效率并不相同,，進而不同外顯子區(qū)段的覆蓋深度差異較大,，因此通常外顯子測序不能用于CNV的檢測。但我們采用國際主流軟件和長期優(yōu)化的分析方法可以針對單個樣本進行SNP,、InDel和CNV變異檢測,。

使用的捕獲平臺是什么，有哪些優(yōu)勢,？

我們使用的是Agilent SureSelect Human All Exon V6捕獲平臺,，該產(chǎn)品汲取多個權(quán)威數(shù)據(jù)庫（如RefSeq，OMIM_cds）的核心內(nèi)容,，具有更大的捕獲區(qū)間,，更高的捕獲效率，保證外顯子編碼區(qū)的高覆蓋率及SNP檢出率,。

外顯子測序為何強調(diào)“有效測序深度”,，與“測序深度”的概念有何區(qū)別？

首先明確兩個概念：

測序深度：測序得到的總堿基數(shù)與目標區(qū)域大小的比值。

捕獲效率：比對到參考基因組中目標區(qū)域的數(shù)據(jù)量占比對到參考基因組上總數(shù)據(jù)量的比例,。

例如：若使用Agilent Sureselect Exome Kit V5,，試劑盒的捕獲范圍為50M，測序得到500M數(shù)據(jù)量時,，測序深度為500/50=10×,；但是由于外顯子試劑盒會有捕獲效率，大約在60%以上,，所以實際上目標區(qū)域數(shù)據(jù)量只有500M*60%=300M,，目標區(qū)域測序深度 300M/50M=6×，稱為target depth,。

疾病基因組外顯子測序深度怎么考慮,？

2015年發(fā)表在Genomics & Informatics上的一篇文章顯示外顯子組測序深度會影響變異檢出率?；谕瑯拥姆椒?，諾禾致源疾病基因組事業(yè)部選取3個不同疾病的樣本進行檢出率和一致性評估，發(fā)現(xiàn)：使用外顯子組測序,相比于常用的50×有效測序深度,，100×有效測序深度下,，功能性SNPs ( coding SNPs 、missense SNPs）和罕見變異（Rare SNPs, MAF<0.5%）的檢出數(shù)量以及目標區(qū)域中20×以上覆蓋深度堿基所占的比例,，均達到一個很平穩(wěn)的狀態(tài),，可以得到顯著、可靠的變異檢出（如圖1-圖4）,。

癌癥基因組學(xué)測序為什么通常選取同一個患者成對的癌組織和癌旁組織/血液樣本,？

癌癥基因組學(xué)側(cè)重于研究腫瘤細胞特有的、非遺傳因素導(dǎo)致的體細胞突變,，因此我們需要選取患者的正常組織進行測序,，以過濾germline mutations。由于考慮到個體間germline突變差異很大,，為避免篩選出很多假陽性體細胞突變位點,，腫瘤和正常組織需來源于同一個體。

癌組織為什么要采用高深度測序,？

相對于遺傳病而言,，腫瘤組織樣品中突變位點的等位基因頻率較低，一方面由于腫瘤細胞在腫瘤組織中的占比偏低,，另一方面則由于癌癥發(fā)展后期產(chǎn)生的突變僅存在于極少量的腫瘤細胞中,，采用高深度測序可以盡可能全面的檢測到與癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的變異。通常推薦的外顯子測序深度為,，癌組織大于100x，癌旁組織/血液大于50x。