題目：A single-cell survey of cellular hierarchy in acute myeloid leukemia 發(fā)表期刊：Journal of Hematology & Oncology (IF:23.2) 發(fā)表年份：2020-09

摘要

Background:急性髓系白血病 （AML） 是一種致命的造血惡性腫瘤，其預(yù)后與遺傳復(fù)雜性相關(guān),。目前尚未有從單細(xì)胞水平對不同 AML 亞型進(jìn)行綜合分析,。Methods:使用Microwell-seq平臺，分析了來自40名患者和3名健康供體的骨髓樣本的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序,。還使用single-cell single-molecule real-time (SMRT)測序來研究AML細(xì)胞的克隆異質(zhì)性,。Results：通過對191727個AML細(xì)胞的數(shù)據(jù)分析，建立了一個單細(xì)胞層面的AML“景觀”,，并鑒定了一群具有新型AML marker的AML祖細(xì)胞群體,推斷出兩種具有不同臨床結(jié)局的AML亞型。聯(lián)合 Microwell-seq 和 SMRT sequencing探究AML中的線粒體突變,。且提出存在一種表型“cancer attractor”, 這可能有助于定義AML祖細(xì)胞具有的共同表型,。最后，通過比較AML landscape和Human Cell Landscape來探索潛在的藥物靶點,。Conclusion:他們鑒定出了一群的AML祖細(xì)胞群,。核糖體蛋白基因水平高表明提示病人預(yù)后不良。還推斷出具有不同臨床結(jié)局的AML亞型,，并探索了潛在的藥物靶點,。這些結(jié)果表明AML存在cancer attractor。

實驗設(shè)計及質(zhì)控

樣本：40 病人和3個健康對照人的骨髓單核細(xì)胞(BMMC,Bone marrow mononuclear cell) 細(xì)胞：

結(jié)果

1.正常人BMMC單細(xì)胞分析

使用了Microwell-seq對三個健康供體BMMC進(jìn)行分析(Figure 1A and B).

Figure 1A and B

鑒定了3種主要的細(xì)胞群體：淋巴細(xì)胞,、紅細(xì)胞和髓系細(xì)胞(Figure1 A 和C).

Figure 1C

中性粒細(xì)胞再細(xì)分為6類細(xì)胞亞群, neutrophil A, neutrophil B, neutrophil C, neutrophil Dneutrophil Eneutrophil F 和neutrophil G(Figure S2).

Figure S2

為了進(jìn)行l(wèi)ineage trajectory分析,，從既往的研究中(數(shù)據(jù)ID號：GSE92274)整合了額外的2000個造血干/祖細(xì)胞（HSPC, hematopoietic stem/progenitor cells）和2719個外周血單核細(xì)胞（PBMC, peripheral blood mononuclear cells），總共獲得13280個健康對照人的細(xì)胞,，使用partition-based graph abstraction (PAGA),構(gòu)建健康人的造血分化軌跡景觀(Figure 1D,E and F)

Figure 1D,E and F

2.鑒定初發(fā)AML的造血細(xì)胞群體

對40個AML樣本和3個健康對照樣本進(jìn)行批次矯正后,，得到20個亞群。中性粒細(xì)胞,，單核細(xì)胞,，紅系細(xì)胞和淋巴細(xì)胞都可在AML樣本和正常樣本中找到(Figure 2A and B).但是中央有一團(tuán)細(xì)胞無特異性的基因表達(dá)(Figure 2C).

Figure 2A, B and C

網(wǎng)絡(luò)圖提示這群團(tuán)細(xì)胞與髓系細(xì)胞很靠近，相關(guān)性圖提示這群基因與HSPC相關(guān),，因此這群細(xì)胞定義為AML progenitor cells.

Figure 2D and E

3.AML progenitor cells的特征

與髓系細(xì)胞相比,，AML progenitor cells和HSPC有許多共同的上調(diào)基因，尤其是核糖體蛋白基因(RP,ribosomal protein genes,Figure 3A).通路富集分析顯示AML祖細(xì)胞具有較高的RB基因轉(zhuǎn)錄活性（圖,。(Figure 3B).

Figure 3A and B

盡管存在RP基因表達(dá)的相似性,，但是一些基因在HSPC，AML progenitor cells和髓系細(xì)胞中的表達(dá)差異還是比較大的,。

基因表達(dá)模式顯示AML progenitor cells處于從HSPC到分化的髓系細(xì)胞的“中間狀態(tài)”,。具體來說，AML progenitor cells中的GATA2,、SPI1和MPO的表達(dá)水平處于中間水平(Figure 3D),。然而,，一些參與primitive state 的基因在AML progenitor cells表達(dá)最高，如SOX4,、FOS和ITM2A (Figure 3E).此外,，CD99、CFD,、RACK1,、FTL、B2M和ADA在AML progenitor cells中表達(dá)量較高,，先前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)這些基因與AML存在關(guān)系(Figure 3F).而且有基因一些與實體瘤相關(guān)的基因,，這些基因與AML的關(guān)系目前尚無報道，例如TMSB10,、SH3BGRL3,、MGST1、MRPL33和MARCKSL1基因(Figure 3G)

Figure 3D, E and F

接著用VIPER（Virtual Inference of Protein-activity by Enriched Regulon）分析,，以揭示AML progenitor cells的轉(zhuǎn)錄因子（TF）活性,。與HSPC相比，髓系細(xì)胞中差異表達(dá)的TF因子包括SPI1,、KLF5和JDP2,，而這些基因都參與造血發(fā)育的過程(Figure S7B).

Figure S7B

然而，參與惡性腫瘤的TF,，如SMARCC1,、HOXA9和HOXB3，在AML progenitor cells是活躍的(Figure 3H).

Figure 3H

4.AML progenitor cells的瘤內(nèi)異質(zhì)性可預(yù)測預(yù)后

AML progenitor cells比例在病人異質(zhì)性很大(Figure S5A).

Figure S5A

將AML progenitor cells分為16個亞群,，并將其歸納為4大類,。Clusters1、2,、3,、4和11為RP gene high clusters。其余3種包括neutrophil-like, monocyte-like, and myeloid cell-like clusters (Figure 4A and B)

Figure 4A and B

一般來說,，這種聚類方法與FAB(French–American–British)分類一致.但是基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示AML progenitor cells的功能狀態(tài)會更詳細(xì),。例如，M5患者可繼續(xù)分為4個clusters,，C5,、C9、C12和C1(Figure S8A).

Figure S8A

富集分析表明,，在RP gene high clusters中,，C1和C2在調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架中起作用。C4與P53通路有關(guān),。C11富含癌蛋白聚糖,。在neutrophil-like種,，C5和C15與IL-17信號通路和癌癥翻譯失調(diào)有關(guān)。C7和C8富含MYC通路(Figure 4C).

Figure 4C

Figure S8D

使用WGCNA探索AML progenitor cells的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),，鑒定了18個模塊（Figure S8E）,。其中，一個模塊由RP基因主導(dǎo)（Figure S8F).

Figure S8E and F

接著展示了這個模塊的基因網(wǎng)絡(luò),。該模塊中的所有RP基因都可以在RP gene high clusters中找到(Figure 4D)

Figure 4D

該模塊中的基因與各種腫瘤通路密切相關(guān),，提示這些基因參與AML的進(jìn)展(Figure 4E).

Figure 4E

5.AML progenitor cells對于從AML的診斷和復(fù)發(fā)的臨床意義

接著觀察治療前后的細(xì)胞比例變化，將N02作為對照,，在緩解樣本中(P-extra 1隊列),，治療后的大多數(shù)細(xì)胞與正常細(xì)胞的重疊，其中AML progenitor cells和增殖細(xì)胞的數(shù)量減少,，而中性粒細(xì)胞增加(Figure 5A-B). 髓系亞群基因在正常細(xì)胞中高表達(dá),，而AML progenitor cells 基因主要在P-extra 1隊列治療前的隊列表達(dá)(Figure 5J). 在緩解的樣本中，RP和primitive genes在治療前表達(dá)量高,，治療之后卻比較低,，中性粒細(xì)胞基因則表現(xiàn)出相反的趨勢(Figure 5J).在復(fù)發(fā)樣本中（P20 隊列）,，骨髓中AML progenitor cells 占主導(dǎo)地位,，RP和primitive genes在治療前和治療后表達(dá)量均高(Figure 5K).

我們將N02作為正常對照。Circos圖顯示了不同州之間的關(guān)系,。熱圖顯示了高度可變的基因,。

Figure 5A-F

Figure 5J-L

6.單核細(xì)胞白血病的瘤內(nèi)異質(zhì)性

然后，將分析重點放在一種亞型AML-M5上,，并整合了15種單核細(xì)胞白血病的數(shù)據(jù),。在此研究中，P06,、P14和P16是難治型AML患者,；其余12例為非難治性患者。AML祖細(xì)胞在患者中的比例差異很大（Figure S11A）,。隨機(jī)選擇了12000個細(xì)胞難治型樣本（C5）和非難治性患者（C13）分析（Figure S11B-E）,。GSEA表明與C13相比，MYC,、SRC,、RELA、原癌基因MTOR相關(guān)通路在C5中過表達(dá),，表明C13惡性程度更高（Figure S11F）,。TCGA-AML中，SRC和MTOR的高表達(dá)水平提示預(yù)后較差（FigureS11G）,。GO分析揭示了 C5中的TF,，如CEBPG,、GATA2、MAX和 JUN基因集在C5中處于激活狀態(tài),，而CEBPE,、GATA1、MAZ,、,，

和JUND基因集在C13處于激活狀態(tài)（FigureS11 H and I）.

Figure S11

7.單細(xì)胞水平SMRT測序與遺傳突變的關(guān)系

由于覆蓋范圍的限制，3′端的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析未能識別基因突變,。因此,，將 long-read sequencing與Microwell seq實驗相結(jié)合。我們使用靶向上游引物和通用下游引物從單細(xì)胞cDNA中擴(kuò)增特定基因進(jìn)行SMRT測序,，可以獲得mutation sites and cell barcodes(Figure 6a).既往研究報道,，mtDNA突變可提供 innate and natural barcodes來推斷細(xì)胞的克隆進(jìn)化。他們選擇線粒體基因MT-ND4,，使用SMRT測序進(jìn)行譜系追蹤,。從P25、P10和P17樣本的單個細(xì)胞中鑒定到了MT-ND4的異質(zhì)變體,。過濾后,，以MT-ND5轉(zhuǎn)錄本為參考，得到平均3406個讀數(shù),。突變位點的平均測序深度為3041,。其中，UMAP聚類后,，每個樣本約有711個read,。接著將這些細(xì)胞分為幾個亞克隆（Figure S12A-C）,。采用monocle3包,，描繪了髓系、紅系和淋巴系的分化軌跡(Figure 6B and Figure S12D and E),。這些亞克隆與細(xì)胞表型的相關(guān)性很差,。在不同的細(xì)胞亞群中檢測到所有MT突變的亞克隆，這表明多個細(xì)胞克隆可能有助于AML分級,，不同的細(xì)胞可能在AML中屬于相似類型的“attractor”(Figure 6C and Figure S12 D-E).

接著使用ARACNe和VIPER的算法來進(jìn)行基因網(wǎng)絡(luò)分析,。Figure 6D and E顯示了在P25患者中，與HSPC細(xì)胞相比,，AML祖細(xì)胞,、AML（E）和正常（f）髓系細(xì)胞的attractor網(wǎng)絡(luò)核心基因。MYB,、RUNX2和YY1是P25的AML祖細(xì)胞獨有的attractor,，可能是誘導(dǎo)癌癥的決定因素,。P10和P17也有自己的attractor網(wǎng)絡(luò).(Figure S12 F-I).(

Figure 6

Figure S12

8.結(jié)合HCL 數(shù)據(jù)庫探究AML靶點

分析AML landscape和Human Cell Landscape兩者的數(shù)據(jù)后，差異分析得到了AML中高表達(dá)基因,。在前10個基因中,，F(xiàn)LT3是眾所周知的，POU4F1也有報道,。其中有一半基因是lncRNA,。其他是PRSS21、CCL1和DNTT(Figure 7A),。相關(guān)分析顯示,，這前10個基因與AML中最相關(guān)的基因一起屬于兩個網(wǎng)絡(luò)(Figure 7B)。RP基因在這兩個網(wǎng)絡(luò)中都起著重要作用,。接著,，研究了AML祖細(xì)胞群中的前5個相關(guān)蛋白編碼基因，這些基因與腫瘤或髓系分化相關(guān)(Figure 7C).

Figure 7

結(jié)論

研究中使用Microwell-seq分析了來自40名AML患者的191727細(xì)胞,，以建立單細(xì)胞層面的AML景觀,。鑒定出具有新型AML標(biāo)志物的惡性AML祖細(xì)胞亞群。祖細(xì)胞RP基因高表達(dá)的患者的緩解率較低,。推斷出兩種具有不同臨床結(jié)局的AML,。我們表明，單細(xì)胞分析可用于預(yù)測和評估AML治療效果,。最后,，通過將Microwell-seq與SMRT測序相結(jié)合,，追蹤了AML景觀中的線粒體突變,，并證明了AML克隆與轉(zhuǎn)錄組表型之間缺乏關(guān)聯(lián)?？傮w研究表明“cancer attractor”的存在可能有助于定義AML祖細(xì)胞的共同表型,。