免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素,、酶、金屬離子,、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)）,，對其進(jìn)行定位、定性及定量的一項(xiàng)技術(shù),。

IHC的實(shí)驗(yàn)流程和方法總體不難,，但做出漂亮的染色結(jié)果卻不容易,，所謂“細(xì)節(jié)決定成敗”，也正是IHC實(shí)驗(yàn)中尤為重要的關(guān)鍵點(diǎn),。

那么“細(xì)節(jié)”主要是哪一些呢,？下面就由Proteintech公司免疫組化部門資深實(shí)驗(yàn)員為您一一道來。（以石蠟組織切片為例介紹）

1)標(biāo)本固定

固定的目的除了使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固,，減少或終止內(nèi)源性或外源性細(xì)胞內(nèi)分解酶的反應(yīng),，防止組織細(xì)胞自溶，更是為了保存組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原性,，使抗原不失活,，不發(fā)生彌散。不同的抗原對固定液耐受程度不同,，因而要選擇合適的固定劑,。

現(xiàn)在常用的固定劑有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液,。有些固定劑對特殊組織有更好效果,，如苦味酸對于頭皮、指甲固定有軟化效果,，Helly固定液對于胰島和垂體效果較好,，PLP固定液對于含糖組織抗原保存更好。

2)脫水,、石蠟包埋和制片

脫水用梯度乙醇(由低到高)充分脫水,，對于一些易脆的組織（如肝,、脾等）應(yīng)減少高濃度酒精里的停留時(shí)間,，透明的時(shí)間也應(yīng)該控制縮短。

對組織浸蠟時(shí),，一般選用56℃~58℃熔點(diǎn)的石蠟,，浸蠟溫度最好不超過60℃，防止抗原的損失,。

包埋時(shí)應(yīng)選好角度動(dòng)作迅速,，以便切片時(shí)有完整的切面。切片時(shí)則要該快則快該慢則慢,，及時(shí)檢查刀片是否出現(xiàn)缺口,，防止蠟帶出現(xiàn)劃痕。

3)脫蠟和水化

使組織恢復(fù)到固定后的正常狀態(tài)暴露出抗原以方便與一抗結(jié)合,。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全,，而產(chǎn)生非特異性背景著色。

4)抗原修復(fù)

由于組織在甲醛或多聚甲醛固定過程中,，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用,，從而掩蓋抗原決定簇,。通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露,，提高抗原檢測率,。

常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓加熱修復(fù),、微波修復(fù),、胰酶修復(fù)。其中高壓加熱修復(fù)這一方法簡便易操作,，效果也更好,。

使用高壓加熱修復(fù)對于修復(fù)溫度和時(shí)間的把握十分重要，溫度越高修復(fù)時(shí)間越短,，溫度與修復(fù)時(shí)間呈負(fù)相關(guān),。修復(fù)結(jié)束后注意室溫冷卻，讓蛋白自然復(fù)性,。其次,，盡量使用過量的抗原修復(fù)液，防止高溫液體揮發(fā)干涸,，對切片造成不可逆的損傷,。

同時(shí)不同pH值修復(fù)液對修復(fù)結(jié)果的也有不同影響。如下圖所示不同修復(fù)液對比的結(jié)果,，所以如何選擇修復(fù)液還因該酌情而定,，不能一成不變。

△60347-1-Ig（CD3G antibody）用檸檬酸修復(fù)后細(xì)胞膜的著色明顯比Tris-EDTA修復(fù)和未修復(fù)的著色多（左圖未進(jìn)行抗原修復(fù),，中間圖使用Tris-EDTA修復(fù),，右圖使用檸檬酸液修復(fù)）

5)滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素

在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)容易受到內(nèi)源性過氧化物酶和生物素的干擾,，必須用過氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活和封閉,。

滅活內(nèi)源性過氧化物酶一般用3%過氧化氫滅活約10 min左右，用甲醇配制過氧化氫更適合于保護(hù)抗原和固定組織,。

6)血清封閉

為了防止一抗與組織的非特異性結(jié)合,，造成假陽性，一般會采用BSA,、羊血清等封閉這些位點(diǎn),，封閉血清一般是和二抗同一動(dòng)物來源的，室溫封閉10-30 min,。

7)一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間

不同的一抗?jié)舛?，孵育時(shí)間和溫度等對染色結(jié)果往往有著較大的影響。在4℃下，反應(yīng)緩慢,，背景較淺,；而37℃反應(yīng)較快，時(shí)間較短,；室溫介于前兩者之間,，選擇室溫孵育有助于實(shí)驗(yàn)流程的便利，同時(shí)也適用于較多樣本的檢測,。二抗一般室溫孵育30 min,。

8)切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)

為了防止一抗,、二抗等殘留而引起非特異性染色,，適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗尤其重要，建議使用洗瓶沖洗 30s X 3 次,，而一抗孵育后可用TBST單獨(dú)清洗,。清洗中要注意單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染,，同時(shí)溫和沖洗,，防止脫片。TBS的pH和離子濃度建議用為7.6-8.0,，濃度是0.01 M,。中性及弱鹼性條件有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解,；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成,，而高離子強(qiáng)度則有利于分解。

9)DAB顯色

背景的深淺和特異性染色的深淺都可以由DAB孵育條件決定,。DAB顯色時(shí)間不是固定的,，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而背景著色較淺時(shí)即可沖洗,。

DAB顯色時(shí)間很短(如幾秒或幾十秒)就出現(xiàn)很深的棕褐色,，這很可能說明一抗?jié)舛冗^高,，需要下調(diào)抗體濃度,；若很短時(shí)間就出現(xiàn)深背景，有可能非特異性蛋白封閉不全,，需要延長封閉時(shí)間,；DAB顯色時(shí)間很長(如超過十分鐘)才出現(xiàn)陽性染色，可能是一抗體濃度過低或者封閉時(shí)間過長,。

對于較弱的DAB顏色有時(shí)可以采取增強(qiáng)方法,。如加入金屬離子：硫酸銅、六亞甲基胺銀,、氯化鈷,、硫酸鎳銨,、氯化鎳及咪唑等。下圖就是DAB顯色后浸泡硫酸銅溶液后的結(jié)果,。

△66340-1-Ig （Bcl 6 antibody）使用常規(guī)DAB染色顏色較淺（左圖）,，而繼續(xù)使用硫酸銅處理顏色就較深（右圖）。

10)復(fù)染

免疫組化染色后必須進(jìn)行復(fù)染,，以襯托出組織形態(tài)結(jié)構(gòu),。目前常用Mayer's蘇木素復(fù)染，一般2 min分鐘左右,，DAB在核蛋白著色則可適當(dāng)縮短復(fù)染時(shí)間,，然后氨水或 pH 8.0的TBS返藍(lán)。

11)封片

為了持久保存,，通常會使用中性樹膠等封片,。封片過程中注意斜靠蓋玻片防止氣泡產(chǎn)生影響觀察。如果樹膠較粘稠可以加入適量二甲苯稀釋,，使樹膠在封片中能夠快速擴(kuò)散開,。在脫水過后建議采取濕封，即組織上還殘留二甲苯時(shí)進(jìn)行封片,，同時(shí)注意在通風(fēng)廚中操作,。這樣有助于氣泡排除干凈，不影響后續(xù)鏡檢,。

想要做出完美的免疫組化實(shí)驗(yàn),，除了拼裝（ren）備（pin），更要靠細(xì)節(jié),！

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