先介紹一下IHC,，官方解釋?zhuān)好庖呓M織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素,、酶、金屬離子,、同位素）顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)）,，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的一項(xiàng)技術(shù),。作為WB的兄弟,，IHC也本著蛋白實(shí)驗(yàn)家族一貫的傳統(tǒng)，我的實(shí)驗(yàn)流程和方法不難,，但是想做出漂亮的染色結(jié)果卻不容易,，有條件的實(shí)驗(yàn)室可能都會(huì)把這個(gè)實(shí)驗(yàn)外包吧，但是個(gè)人認(rèn)為,，IHC是我們必須要掌握的一項(xiàng)技能,，動(dòng)手學(xué)一下還是挺有意思的，我們以石蠟組織切片為例：

1) 標(biāo)本固定

固定的目的：1,、使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固,，減少或終止細(xì)胞內(nèi)分解酶的反應(yīng)；2、防止組織細(xì)胞自溶,，保存組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原性,，使抗原不失活，不發(fā)生彌散,。

IHC免疫組化，固定組織時(shí),，必須有足夠的固定液,，一般為組織塊體積的10～15倍。

固定用的容器必須足夠大,，組織材料不要太多,，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要切成米粒大小，大小宜為1.0cm X l.0 cm X 0.2cm,，組織太大,，內(nèi)部得不到充分固定，會(huì)導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)破壞,，增加非特異染色,，還浪費(fèi)試劑。同時(shí)避免組織中的水分滲出而影響固定液的濃度,。組織取材后應(yīng)立即固定,，否則，組織易收縮變形,，并發(fā)生自溶現(xiàn)象,。組織固定后，因固定液滲到組織中,，所以必須徹底沖洗,，除去固定液，否則會(huì)影響下一步的脫水,。

2) 脫水,、石蠟包埋和制片

用乙醇(由低到高)充分脫水，對(duì)于一些質(zhì)地易脆的組織（如肝,、脾等）,，注意不要在高濃度酒精里的停留過(guò)長(zhǎng)時(shí)間。

組織浸蠟時(shí),，一般選用56℃~58℃熔點(diǎn)的石蠟,，浸蠟溫度最好不超過(guò)60℃，防止抗原的損失,。

包埋時(shí)的操作就考驗(yàn)熟練度了,。選擇好角度后，動(dòng)作要迅速，這樣才能保證切片時(shí)切面完整,。但是切片時(shí)則要控制好速度,，快慢適宜，同時(shí)選用完整的刀片,，防止蠟帶出現(xiàn)劃痕,。

3)脫蠟和水化

待組織恢復(fù)到正常狀態(tài)，暴露出抗原與一抗結(jié)合,。如果脫蠟和水化做得不完全,，會(huì)使后期結(jié)果產(chǎn)生非特異性背景著色。脫蠟就是給石蠟切片“脫衣服”的過(guò)程,，即,，用二甲苯將石蠟從切片上“脫”下來(lái)，總共脫3次,，每次5min,。水化，也就是說(shuō)復(fù)水的目的就是利用乙醇的雙溶性,，使得切片跟后續(xù)的水溶性實(shí)驗(yàn)體系相容,。這一步中，我們使用100%乙醇和95%乙醇各洗切片2次,，每次10min,。

4) 抗原修復(fù)

抗原修復(fù)是IHC中極為重要的一步，組織在甲醛或多聚甲醛浸泡固定過(guò)程中,，會(huì)發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用,，從而掩蓋抗原決定簇。所以抗原修復(fù)是為了使胞內(nèi)抗原決定族重新暴露出來(lái),，提高抗原檢測(cè)率,。

常用的修復(fù)方法包括高壓加熱修復(fù)、微波修復(fù)和胰酶修復(fù),。其中高壓加熱修復(fù)這一方法簡(jiǎn)便易操作,，效果也更好。

使用高壓加熱修復(fù)時(shí),，要注意修復(fù)的溫度和時(shí)間,，溫度越高修復(fù)時(shí)間越短。修復(fù)結(jié)束后室溫冷卻,，讓蛋白自然復(fù)性,。同時(shí)，為了防止高溫時(shí)液體揮發(fā),，對(duì)切片造成不可逆的損傷,，應(yīng)盡量使用過(guò)量的抗原修復(fù)液,。 

5) 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素

免疫組化反應(yīng)容易受到內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素的影響，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶一般用3%過(guò)氧化氫,。滅活約10 min左右,，用甲醇配制過(guò)氧化氫更適合于保護(hù)抗原和固定組織。此時(shí)類(lèi)似于一張濕轉(zhuǎn)后的western blot膜,。

6)血清封閉

為了防止一抗的非特異性結(jié)合,，造成假陽(yáng)性，一般會(huì)采用BSA,、羊血清等封閉這些位點(diǎn),，封閉血清一般是和二抗同一動(dòng)物來(lái)源的，室溫封閉10-30 min,。

（第一次做免疫組化忘記封閉的結(jié)果）

7) 一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間

不同的一抗?jié)舛龋跤龝r(shí)間和溫度等對(duì)染色結(jié)果都會(huì)有不同,。在4℃下,，反應(yīng)緩慢，背景較淺,；而37℃反應(yīng)較快,，時(shí)間較短；室溫介于前兩者之間,，一般情況下,，會(huì)選擇室溫孵育就可以。二抗一般室溫孵育30 min,。

8) 切片清洗(浸洗,、沖洗和漂洗)

為了防止一抗、二抗等殘留而引起非特異性染色,，建議使用洗瓶沖洗 每次30s,，清洗3 次，可用TBST單獨(dú)清洗一抗孵育后,。清洗中要注意每個(gè)標(biāo)本單獨(dú)沖洗,，以防造成污染，同時(shí)沖洗力度溫和,，防止脫片,。

9) DAB顯色

DAB顯色時(shí)間不是固定的，可以通過(guò)顯微鏡下觀察,，控制顯色時(shí)間,，鏡下觀察出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而背景著色較淺時(shí)即可沖洗。

如果DAB幾秒或幾十秒就會(huì)出現(xiàn)很深的棕褐色,，有可能是由于一抗?jié)舛冗^(guò)高,，需要適當(dāng)下調(diào)抗體濃度,；若很短時(shí)間就出現(xiàn)深背景，有可能是非特異性蛋白封閉不全,，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間,；若果DAB顯色時(shí)間超過(guò)十分鐘才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，可能是一抗體濃度過(guò)低或者封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng),。

對(duì)于較弱的DAB顏色可以采取增強(qiáng)方法,，比如可以選擇加入硫酸銅。