高血壓是一種以高發(fā)病率和死亡率為特征的主要公共衛(wèi)生問題，它顯著增加了心臟,、大腦,、腎臟和其他疾病的風(fēng)險。高血壓的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣,，大多數(shù)是由延髓頭端腹外側(cè)區(qū)的活性氧/氮(RONS)（·OH,、NO、O₂^·—,、ONOO^—和H₂O₂）引起的炎癥和氧化應(yīng)激,。延髓頭端腹外側(cè)區(qū)(RVLM)是調(diào)節(jié)交感神經(jīng)流出的關(guān)鍵整合中心，也是中樞調(diào)控心血管活動的重要部位之一,。同時,，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)和線粒體呼吸鏈作為RONS的主要來源，可以通過增加交感神經(jīng)興奮性和減少NO供應(yīng)導(dǎo)致高血壓發(fā)生,。一般來說,，NO具有神經(jīng)保護(hù)作用，但它會與O₂一起產(chǎn)生有毒的ONOO^—,，在低氧條件下抑制線粒體呼吸和損傷細(xì)胞,。

    以往研究表明，神經(jīng)炎癥的過程伴隨著神經(jīng)源性高血壓。小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦組織中的同源巨噬細(xì)胞,，在抵抗病原體入侵,、受RONS攻擊等不良刺激后轉(zhuǎn)化為活化的促炎狀態(tài)、釋放炎癥因子等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,。在激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的驅(qū)動下,，NOX的過度表達(dá)會產(chǎn)生過量的ROS，導(dǎo)致DNA損傷,，影響細(xì)胞膜的完整性，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,。具有抗氧化能力的天然酶,，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD),、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和過氧化氫酶(CAT),，組成了一個強(qiáng)大的防御系統(tǒng)，以維持氧化還原平衡,。然而,，天然酶的穩(wěn)定性低、易降解,、對環(huán)境敏感,、成本高、在疾病發(fā)展過程中難以充分補(bǔ)充,，這在很大程度上限制了生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用,。

    大量研究證明了金屬納米酶對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的保護(hù)作用，基于金屬和金屬氧化物的納米顆粒,，例如金,、銀、銅,、鉬,、鉑、鈰,、鐵,、釩、黑色素以及碳基納米系統(tǒng),，已被開發(fā)用于催化,、成像、傳感,、神經(jīng)保護(hù),、抗炎、抗氧化、抗菌,、抗腫瘤和抗衰老等領(lǐng)域,，然而到目前為止，人工納米酶對高血壓的治療還沒有被探索和論證,。

為了彌補(bǔ)納米酶在降壓領(lǐng)域中的不足,，本研究設(shè)計(jì)合成了具有多酶活性的超微量鐵氰化鈣納米酶用于清除RONS，減少炎癥,，抑制細(xì)胞凋亡,，減輕氧化應(yīng)激引起的炎癥和神經(jīng)毒性，為納米藥物有效治療高血壓提供了新策略,。

圖a：六氰基鐵酸鉀(Ⅲ)(K₃[Fe(CN)₆])、氯化鈣(CaCl₂)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)被用來合成單分散的CAHF NPs,。

圖b：透射電子顯微鏡(TEM)圖像顯示CAHF NPs分布均勻,，結(jié)構(gòu)接近球形。

圖c：動態(tài)光散射(DLS)法測定了CAHF NPs在水中的尺寸分布,。

圖d：CAHF NPs在H₂O,、PBS、DMEM和FBS中的Zeta電位分別為6.7,、45.2,、15.9和13.3mV。

圖e：CAHF NPs在紫外區(qū)有很強(qiáng)的吸收,。

圖f：CAHF NPs和PVP的傅里葉變換紅外光譜(FTIR),，表明PVP和Fe[(CN)₆]^3-成功連接。

圖g：X射線光電子能譜分析表明,，C 1s,、Ca 2p和Fe 2p的特征峰分別為284.9、346.8和708.8 eV,。

二,、CAHF NPs的類酶活性

    CAHF NPs具有四種模擬酶活性，包括SOD,、POD,、GPx和CAT，計(jì)算出CAHF NPs的超氧化物歧化酶比活力為1.25X103 U/mg,，比其他金屬基納米酶,，如Cu-SAzyme(448.22  U/mg)和Fe₃O4納米酶(5.65 U/mg)分別高出2.7和250倍，表現(xiàn)出較高的抗氧化能力,，有效地清除了細(xì)胞內(nèi)的RONS(·OH,、NO,、O2^·—、ONOO^—和H2O2)并在細(xì)胞保護(hù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,。

圖a：CAHF NPs的SOD模擬活性,。

圖b：CAHF NPs的GPx模擬活性，其中NADPH的吸光度變化具有時間依賴性,。

圖c：CAHF NPs模擬GPx活性的Michaelis-Menten曲線,。

圖d：CAHF NPs的POD模擬活性。

圖e：不同濃度CAHF NPs處理后TMB的吸收光譜,。

圖f：CAHF NPs模擬POD活性的Michaelis-Menten曲線,。

圖g：CAHF NPs的模擬CAT活性，其中O2的產(chǎn)生具有時間依賴性,。

圖h：CAHF NPs模擬CAT活性的Michaelis-Menten曲線,。

圖i：不同處理后DPPH的吸收光譜。

三,、CAHF NPs對體外氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用

    CAHF NPs能夠保護(hù)細(xì)胞免受ROS誘導(dǎo)的氧化損傷，經(jīng)H2O2刺激后,，BV2和N2a細(xì)胞的凋亡率和壞死率分別增加到31.4%和38.7%,，然而，在CAHF NPs治療后,，凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)顯著減少,。同時，CAHF NPs也能減輕細(xì)胞內(nèi)線粒體的氧化損傷,。

圖a：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)檢測BV2和N2a細(xì)胞的細(xì)胞活力,，在選定的濃度下，CAHF NPs具有不明顯的細(xì)胞毒性,。

圖b：BV2和N2a細(xì)胞在過氧化氫處理后細(xì)胞活力均下降,，且呈濃度依賴性。

圖c：與過氧化氫組相比,，CAHF NPs處理后細(xì)胞存活率提高,。

圖d：不同處理后Calcein-AM/PI染色的BV2和N2a細(xì)胞的激光共聚焦顯微鏡圖像。

圖e：用流式細(xì)胞儀檢測過氧化氫誘導(dǎo)的BV2和N2a細(xì)胞的凋亡率和壞死率,。

圖f：用DCFH-DA染色的BV2或N2a細(xì)胞經(jīng)不同處理后的CLSM圖像,。過氧化氫處理后細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加，而CAHF NPs處理后的熒光強(qiáng)度明顯降低,。

圖e：用JC-1染色的BV2和N2a細(xì)胞經(jīng)不同處理后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析,。

四、CAHF NPs的體外抗炎作用

    CAHF NPs能夠通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子和清除RONS來保護(hù)BV2細(xì)胞免受炎癥性損傷,。

圖a：Western blot分析,。CAHF NPs治療后，與LPS組相比，促炎因子IL-1β,、TNF-α和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)水平顯著降低,，而抗炎因子IL-10水平顯著升高。

圖b：BV2細(xì)胞中iNOS,、IL-1β,、TNF-α和IL-10的相應(yīng)分析。

圖c：BV2細(xì)胞IL-1b(綠色)和iNOS(紅色)免疫熒光染色,。

圖de：IL-1b和iNOS在BV2細(xì)胞中相對蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)直方圖,。

圖f：BV2細(xì)胞內(nèi)ROS和RNS的CLSM圖像。

圖gh：BV2細(xì)胞ROS和RNS水平的統(tǒng)計(jì)直方圖,。

圖i：流式細(xì)胞儀分析BV2細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光水平,。

圖j：不同處理后BV2細(xì)胞內(nèi)ROS的平均熒光強(qiáng)度。

圖k：培養(yǎng)上清液中BV2細(xì)胞分泌的RNS水平,。

五,、CAHF NPs的體內(nèi)毒性研究

    CAHF NPs具有良好的生物安全性，可用于體內(nèi)評價和應(yīng)用,。

六,、CAHF NPs的體內(nèi)降壓和抗炎作用

    建立應(yīng)激性高血壓(SIH)大鼠模型，用股動脈測壓法測量大鼠的血壓,。刺激后大鼠MAP,、ABP、SBP,、DBP,、HR和腎交感神經(jīng)活動(RSNA)水平顯著升高，在CAHF NPs預(yù)處理后顯著降低,，初步證實(shí)了CAHF NPs的體內(nèi)降壓作用,。

    在正常腦組織中，小膠質(zhì)細(xì)胞是高度分枝的,，當(dāng)大腦發(fā)生炎癥,、感染、創(chuàng)傷或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病時,，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速激活,，并通過擴(kuò)大細(xì)胞體、縮短其突起,，最終變成圓形或桿狀,，Sholl和骨骼分析結(jié)果顯示，與正常大鼠相比,，SIH大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,，胞體變大,，分支減少。CAHF NPs預(yù)處理后,，小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)恢復(fù)到維持正常功能,。同時，CAHF NPs可降低高血壓大鼠的血壓,，抑制體內(nèi)促炎細(xì)胞因子的分泌,。

圖a：高血壓模型建立過程的示意圖。

圖b：不同處理后大鼠的ABP,、HR,、SBP、MAP,、DBP圖像,。

圖c：小膠質(zhì)細(xì)胞在不同處理后IBA1(綠色) 的免疫熒光染色以及Sholl和骨架分析。

圖de：不同治療后大鼠IL-1β,、TNF-α,、COX2、iNOS,、CD86,、Arg1的Western blot以及相應(yīng)分析。

圖fgh： IL-1b(紅色),、iNOS(綠色)、DAPI(藍(lán)色)的免疫熒光染色及相應(yīng)分析,。

七,、CAHF NPs體內(nèi)抗細(xì)胞凋亡和清除ROS的作用

    CAHF NPs預(yù)處理大鼠的TUNEL+神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯少于SIH大鼠。同時,，CAHF NPs預(yù)處理顯著減弱了SIH大鼠促凋亡因子caspase-3,、caspase-9和Bax的蛋白表達(dá)水平，提高了凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白表達(dá)水平,。這些結(jié)果表明,，CAHF NPs通過參與對凋亡因子的調(diào)控保護(hù)細(xì)胞免受凋亡損傷。

    NOx是高血壓時ROS過度表達(dá)的主要因素,，經(jīng)CAHF NPs處理后,，NOX2和NOX4的蛋白表達(dá)水平明顯下降。此外,，CAHF NPs治療后,，SiH大鼠RVLM中的ROS水平明顯受到抑制，表明CAHF NPs在治療SIH中具有良好的抗氧化保護(hù)性能,。這些結(jié)果證實(shí)了CAHF NPs在體內(nèi)對細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的保護(hù)作用,。

圖a：大鼠RVLM內(nèi)TUNEL(綠色)和DAPI(藍(lán)色)的免疫熒光染色,。

圖b：TUNEL+細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)直方圖。

圖c：大鼠RVLM內(nèi)caspase-3(綠色)和DAPI(藍(lán)色) 的免疫熒光染色,。

圖d：caspase-3熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)直方圖,。

圖ef：不同處理后大鼠caspase-3、caspase-9,、Bax,、Bcl-2的Western blot以及相應(yīng)分析。

圖gh：不同處理后大鼠NOX2和NOX4的Western blot以及相應(yīng)分析,。

圖ij：不同處理組大鼠RVLM中ROS(綠色)和DAPI(藍(lán)色)的免疫熒光染色和對應(yīng)分析,。

圖k：不同處理組大鼠RVLM組織中過氧化氫酶的水平。

八,、CAHF NPs對自發(fā)性高血壓大鼠的治療機(jī)制

    為了探討CAHF納米顆粒的降壓機(jī)制,，對SiH和SiH+CAHF大鼠進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明CAHF納米粒的降壓機(jī)制可能是通過抗氧化,、抗炎和抗細(xì)胞凋亡途徑來實(shí)現(xiàn)的,。

圖a：SIH組和SIH+CAHF NPs組之間的轉(zhuǎn)錄圖譜的Venn圖。兩組共表達(dá)19,613個基因,，而CAHF NPs處理組僅表達(dá)735個基因.

圖b：CAHF NPs治療后顯著上調(diào)和下調(diào)的基因的火山圖,。顯示了84個顯著差異表達(dá)基因(DEG)，其中52個顯著上調(diào),，32個顯著下調(diào),。

圖c：CAHF NPs處理后Q值顯著差異表達(dá)基因的熱圖。

圖d：對不同處理(BP,、CC和MF代表生物學(xué)過程,、細(xì)胞成分和分子功能)的SIH大鼠差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集化分析。CAHF NPs明顯改變了與免疫反應(yīng),、免疫系統(tǒng)過程和免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫反應(yīng)途徑,、一氧化氮生物合成過程、一氧化氮合酶2(NOS2)-分化簇74(CD74)復(fù)合體,、多Th細(xì)胞分化(Th1,、Th2和Th17)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和精氨酸合成相關(guān)的信號通路,，表明CAHF NPs的降壓機(jī)制與抗炎和NO合成有關(guān),。

圖e：前20個顯著豐富的KEGG途徑。

圖f：對不同處理的SIH大鼠的相關(guān)基因進(jìn)行Circos分析,。Circos分析表明與氧化,、炎癥和凋亡相關(guān)的代表性基因，包括超氧化物歧化酶1(SOD1),、過氧化還蛋白1(Prdx1),、熱休克60 kDa蛋白1(Hspd1),、小鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物3(AKT3)、絲裂原活化蛋白激酶10(Mapk10)和Bex2在兩組之間存在差異表達(dá),。