查找目的基因序列并不能直接用于我們研究所用，因?yàn)椴檎业降幕蛐蛄兄荒芩闶腔虻碾娮有蛄?，并不是我們研究要用的現(xiàn)實(shí)中的序列,，如何獲得現(xiàn)實(shí)的基因序列呢？這就需要我們根據(jù)基因的電子序列來設(shè)計(jì)引物了,，通過引物借助PCR方法才能獲得我們的目的基因序列,。接下來，我們將介紹一下PCR方法并講述如何設(shè)計(jì)引物,。

PCR（polymerase chain reaction）,，即聚合酶鏈反應(yīng)，又稱基因體外擴(kuò)增技術(shù),，是由一對引物介導(dǎo),、能在體外對特定DNA 片段進(jìn)行快速酶促擴(kuò)增的技術(shù)。PCR能把很微量的遺傳物質(zhì)在數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增數(shù)百萬倍達(dá)到檢測水平．使原來無法進(jìn)行分析和檢測的許多項(xiàng)目得以完成,。PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對合適的核苷酸片段,，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否,。對引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功,，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計(jì),。

1.引物的特異性

引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源,。

2.避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū) 

某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域,。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu),，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明,，待擴(kuò)區(qū)域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol時(shí),，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí),，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴(kuò)增的成功是有幫助的,。

3.長度

寡核苷酸引物長度為15~30bp，一般為20~27mer,。引物的有效長度：Ln=2（G+C）+（A+T）Ln值不能大于38,，因?yàn)?/span>>38時(shí),，最適延伸溫度會超過Taq DNA聚合酶的最適溫度（74℃),不能保證產(chǎn)物的特異性。

4.G+C含量

G+C含量一般為40%~60%,。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度,，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度,，有效啟動溫度,，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值,，則有效引物的Tm為55~80℃,，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。

5.堿基隨機(jī)分布 

引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的,，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在,。尤其3′端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā),。

6.引物自身

引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合,。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp,。

7.引物之間

兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)性,，尤應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性,。

8.引物的3′端

引物的延伸是從3′端開始的,，不能進(jìn)行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能,，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應(yīng)中,，引物3′端不能發(fā)生錯(cuò)配。

 在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中,，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四種dNTP各200μmol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板,，按95℃，25s,；55℃,，25s；72℃,，1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1 gag基因區(qū)的條件下,，引物3′端錯(cuò)配對擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。A∶A錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20,，A∶G和C∶C錯(cuò)七下降至1/100,。引物A：模板G與引物G：模板A錯(cuò)配對PCR影響是等同的,。

9.引物的5′端

引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大,。因此,，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn),；標(biāo)記生物素,、熒光、地高辛,、Eu3+等,；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn),、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等,。

10.密碼子的簡并 

如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位,，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并,，會影響擴(kuò)增特異性與效率。

隨著人們對引物的認(rèn)識,，一些引物的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)程序也應(yīng)運(yùn)而生,，下面將討論有關(guān)引物計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)方法。現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)軟件有primer5.0比較好,，現(xiàn)介紹一下primer5.0及其使用方法：

Primer5.0中文使用說明  

Primer Premier5.0是由加拿大的Premier公司開發(fā)的專業(yè)用于PCR或測序引物以及雜交探針的設(shè)計(jì),，評估的軟件，和Plasmid Premier2.02一起是該公司推出的最新的軟件產(chǎn)品,。其主要界面同樣也是分為序列編輯窗口（Genetank）,，引物設(shè)計(jì)窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和紋基分析窗口（Motif）,。這里我們主要介紹其引物設(shè)計(jì)功能,，其他功能的介紹請參看Plasmid Premier2.02。 

打開程序首先進(jìn)入的是序列編輯參看,，與Plasmid Premier相比,，其多了一個(gè)語音校正的功能,，即在輸入序列的時(shí)候,，程序自動將堿基讀出,，以便用戶進(jìn)行校正，保證輸入的正確和快速,。

點(diǎn)擊該界面的按鈕即可進(jìn)入到程序的引物設(shè)計(jì)窗口,。

該界面共分為四層，最上面一層左面是5個(gè)控制按鈕,，用于實(shí)現(xiàn)引物設(shè)計(jì)中的各種功能,，包括引物自動尋找,，尋找結(jié)果查看和引物編輯；右邊是觀察兩個(gè)引物在模板上結(jié)合位置的直觀圖以及對正鏈還是負(fù)鏈引物進(jìn)行選擇,；第二層是顯示模板和引物序列及二者間的配對情況的顯示,；第三層是顯示兩個(gè)引物的各種參數(shù)，包括給引物的打分,，引物以及產(chǎn)物的起始位置,、長度、Tm值,、GC％消光系數(shù),、簡并性；最后一層是給出的有關(guān)于引物的二聚體結(jié)構(gòu),、發(fā)卡結(jié)構(gòu),、錯(cuò)配情況和引物間二聚體結(jié)構(gòu)的預(yù)測，左邊是顯示是否存在以上各種對PCR擴(kuò)增有影響的結(jié)構(gòu),，右邊顯示的是這些結(jié)構(gòu)的位置,，結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)和穩(wěn)定能，利用這些參數(shù)可以對引物作出可靠的評價(jià),。

下面是根據(jù)模板序列尋找引物的界面,，在該界面中可以設(shè)定所要搜索的引物的類型，包括PCR引物,，測序引物和雜交探針以及引物所在的鏈,；另外也能設(shè)定搜索引物的范圍，以及最終PCR產(chǎn)物的長度和引物的長度等,。

并通過來點(diǎn)擊按鈕來設(shè)置一些搜尋參數(shù)：

這些參數(shù)包括引物的Tm值，GC比,，有簡并性堿基,，3’端穩(wěn)定性，引物的穩(wěn)定性,，重復(fù)序列,，二聚體/發(fā)卡結(jié)構(gòu)和與模板及可能的雜質(zhì)DNA（需要從另外的序列文件中讀入）之間的錯(cuò)配情況，這些參數(shù)的設(shè)定可以根據(jù)要求變化,，程序本身根據(jù)一定的標(biāo)準(zhǔn)分成從極高嚴(yán)謹(jǐn)性到極低嚴(yán)謹(jǐn)性5個(gè)檔次,。該程序?qū)σ锏淖詣铀阉鬟^程是采用的排除法，根據(jù)用戶設(shè)定的引物范圍和產(chǎn)物長度所規(guī)定區(qū)域內(nèi),，所有的符合設(shè)定的引物長度的寡核苷酸都被視為可能的引物,，然后根據(jù)以上各個(gè)參數(shù)逐步去除不符合條件的寡核苷酸，經(jīng)過這種層層剔除的篩選,，最終找到符合用戶所設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的引物,，如果找不到合適的引物可以逐步降低要求來進(jìn)行進(jìn)一步搜尋,。

搜尋到引物結(jié)果最終顯示在下面的窗口中：

在結(jié)果窗口中給出了程序給該對引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和長度以及產(chǎn)物的長度。過直接點(diǎn)擊各對引物在相應(yīng)引物搜尋界面中相應(yīng)的顯示引物的各種信息,。包括其各種參數(shù)和各種可能存在的不利結(jié)構(gòu),。

其中用File菜單中的Parameter命令可以對系統(tǒng)參數(shù)，PCR反應(yīng)條件和程序打分系統(tǒng)進(jìn)行設(shè)置,，以幫助用戶根據(jù)自己的特殊要求來進(jìn)行引物設(shè)計(jì),，其中反應(yīng)條件按照引物濃度，單價(jià)離子濃度,，Mg離子濃度,，Na鹽濃度等。利用該打分系統(tǒng)可以為對引物進(jìn)行有效評估和和在引物之間進(jìn)行對比選擇提供有效的有效的依據(jù),。

最后還可以在利用引物編輯窗口對程序自動找到的或手工找到的引物序列進(jìn)行編輯,，以便用戶能在引物引入突變及加入特定的酶切位點(diǎn)，并對修改后的序列的二聚體結(jié)構(gòu),、發(fā)卡結(jié)構(gòu)和錯(cuò)配進(jìn)一步評估,。其中是對修改后的引物再次搜尋找出其最合適的引發(fā)位置。

除了以上的直觀地對引物進(jìn)行基本的設(shè)計(jì)和評估功能外,，該程序還提供了多種數(shù)據(jù)報(bào)告,，主要通過Report菜單和Graph菜單中命令來實(shí)現(xiàn)：

另外，Primer Premier在引物設(shè)計(jì)上一個(gè)比較獨(dú)到的功能,，就是能輔助進(jìn)行巢式PCR引物設(shè)計(jì),，在首先進(jìn)行了引物自動搜索后，即可通過Function菜單中Multiplex/Nested Primer命令進(jìn)入巢式PCR引物設(shè)計(jì),，通過點(diǎn)中代表各個(gè)引物的三角號來選擇引物,，然后根據(jù)最下面的窗口中各個(gè)引物之間的二聚體形成情況來判斷引物是否適合于作為巢式PCR的引物。另外該菜單中的Database命令可以讓用戶建立自己的引物數(shù)據(jù)庫,，方便于查找和對照,。

整體而言，Primer Premier這個(gè)軟件在引物設(shè)計(jì)方面還是比較優(yōu)秀的,，能夠?qū)θ娴慕o出一個(gè)引物的各種參數(shù),，并在多個(gè)必需的方面對引物作出有效的評價(jià)，但是在程序設(shè)計(jì)中還有一些不足,，例如在錯(cuò)配情況中,，只對是否存在錯(cuò)配作出了預(yù)測，也給處理錯(cuò)配的穩(wěn)定性,，但是錯(cuò)配對PCR的影響還需要根據(jù)錯(cuò)配是否發(fā)生在引物的3’來判斷,，3’發(fā)生的錯(cuò)配要比其他位置的錯(cuò)配對引物的引發(fā)效率的影響大的多，所以在使用中應(yīng)當(dāng)結(jié)合著錯(cuò)配的具體配對情況來綜合分析,，這方面程序未能進(jìn)行量化,，只有通過用戶根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷,；另外，程序?qū)τ诋a(chǎn)物的Tm值和引物Tm值之間的差異也為能給出評價(jià),，如果二者差異較大（如>22℃）,，則容易造成退火時(shí)引物－模板和模板－模板退火之間的競爭。而在結(jié)果輸出方面,，該程序也只能以圖文格式打印,，無法轉(zhuǎn)換成文本格式。