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引物設(shè)計(jì)重點(diǎn)考慮因素、設(shè)計(jì)技巧及引物設(shè)計(jì)軟件推薦
我最近合成了幾十對(duì)引物,，,，在實(shí)戰(zhàn)中多多少少有些心得，拿出來給大家分享,。我感覺想把引物合成的比較好,，除了前引物和后引物的Tm不能相差太大，我們還要重點(diǎn)考慮以下因素：
一,、GC% GC含量 對(duì)于PCR反應(yīng)來說GC含量在40%—60%,，一般50%左右比較合適；而對(duì)于測(cè)序引物和雜交探針來說GC含量至少應(yīng)為50%,。產(chǎn)物中GC含量最好大于引物中的GC含量,。 二、Degeneracy 多義性 當(dāng)設(shè)計(jì)多義引物時(shí)應(yīng)盡量減少引物多義性,，這樣會(huì)帶來更好的特異性,，應(yīng)盡量避免3末端的多義性，因?yàn)檫@里即使一個(gè)堿基的錯(cuò)配都能阻止引物延伸,。 三,、3’ End Stability 3 末端穩(wěn)定性 引物穩(wěn)定性影響它的錯(cuò)配效率，一條理想的引物應(yīng)該有一個(gè)穩(wěn)定性較強(qiáng)的5 末端和相對(duì)穩(wěn)定性較弱的3 末端,。如果引物3 穩(wěn)定性強(qiáng),，有可能在即使5 末端不配對(duì)的情況下造成錯(cuò)配，形成非特異性擴(kuò)增條帶（secondary bands） ,。而3 末端穩(wěn)定性低的引物較好的原因是在引物發(fā)生錯(cuò)配時(shí),，由于3 末端不太穩(wěn)定引物結(jié)合不穩(wěn)定而難以延伸。 四,、GC Clamp GC鉗 引物與目的位點(diǎn)的有效結(jié)合需要有穩(wěn)定的5 末端,。這一段有較強(qiáng)穩(wěn)定性的5 末端稱為GC鉗。它保證引物與模板的穩(wěn)定結(jié)合,。選擇有合適穩(wěn)定性的引物能在確保不產(chǎn)生非特異性條帶的前提下盡量降低退火溫度,。 五、Secondary Structures 二級(jí)結(jié)構(gòu) 二級(jí)結(jié)構(gòu)是引物設(shè)計(jì)中必須考慮的一個(gè)重要因素,。二級(jí)結(jié)構(gòu)能顯著影響反應(yīng)中能與模板正確結(jié)合的引物數(shù)量,，發(fā)卡結(jié)構(gòu)的存在能限制引物與目的位點(diǎn)的結(jié)合能力，從而降低擴(kuò)增效率,，形成發(fā)卡環(huán)的引物則不能在PCR擴(kuò)增中發(fā)揮作用,。 六、Hairpin 發(fā)卡結(jié)構(gòu) 發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是由于引物自身的互補(bǔ)堿基分子內(nèi)配對(duì)造成引物折疊形成的二級(jí)結(jié)構(gòu),，并由于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是分子內(nèi)的反應(yīng),僅僅需要三個(gè)連續(xù)堿基配對(duì)就可以形成,。發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可以用自由能衡量,。自由能大小取決于堿基配對(duì)釋放的能量以及折疊DNA形成發(fā)卡環(huán)所需要的能量，如果自由能值大于0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會(huì)干擾反應(yīng),，如果自由能值小于0 則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng),。 七、Dimer 二聚體 引物之間的配對(duì)區(qū)域能形成引物二聚體,，它是相同或不同的兩條引物之間形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。它造成引物二聚體擴(kuò)增并減少目的擴(kuò)增產(chǎn)物,，二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向引物之間形成,，如果配對(duì)區(qū)域在3 末端問題會(huì)更為嚴(yán)重，3 末端配對(duì)很容易引起引物二聚體擴(kuò)增,。 八,、False Priming 錯(cuò)配 如果引物可以結(jié)合除目的位點(diǎn)外的其他區(qū)域，擴(kuò)增效率將明顯降低目的產(chǎn)物帶將減少或出現(xiàn)涂布（smear）,。3 末端連續(xù)幾個(gè)堿基配對(duì)形成錯(cuò)配的傾向要高于引物上游區(qū)域同樣數(shù)量的堿基配對(duì),，在使用引物設(shè)計(jì)軟件時(shí)，您可以分別設(shè)定確認(rèn)為錯(cuò)配的3 末端或引物全長(zhǎng)形成連續(xù)堿基配對(duì)的數(shù)量,。 順便說一下,，如果是新手，剛開始接觸引物設(shè)計(jì),，推薦使用Primer Premier 5.0,，因?yàn)樗缑婧?jiǎn)單，易學(xué)易用,；如果你想把引物設(shè)計(jì)得盡善盡美,，公認(rèn)的首選軟件是Oligo，其次我認(rèn)為是DNAstar,。Oligo功能強(qiáng)大,，所以使用起來就沒有Primer Premier 5.0那么簡(jiǎn)便。先用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì),，然后把設(shè)計(jì)好的引物拿到Oligo里去檢測(cè)這對(duì)引物的優(yōu)劣,，我想這對(duì)大多數(shù)引物設(shè)計(jì)者是一個(gè)不錯(cuò)的選擇！ 補(bǔ)充一：具體說一下引物中GC含量問題 引物的GC含量一般為40-60%,，以45-55％為宜,，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高,，導(dǎo)致引物的GC含量不能在上述范圍內(nèi),，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇,。如果G-C比例超出,，則在引物的5’端增加As或Ts,；而如果A-T比例過高，則同樣在5’端增加Gs或Cs,。但也有認(rèn)為：原來普遍認(rèn)為PCR引物應(yīng)當(dāng)有50%的GC/AT比率的觀點(diǎn)其實(shí)是不對(duì)的,，以人基因組DNA為模板，用81%AT的引物可以產(chǎn)生單一的,、專一的,、長(zhǎng)250 bp，含有70% AT的產(chǎn)物,。完全沒有必要復(fù)雜地去計(jì)算產(chǎn)物和引物的解鏈溫度,，PCR引物的GC/AT比率應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓腉C/AT比 補(bǔ)充二：關(guān)于自由能問題（如何根據(jù)自由能判斷引物質(zhì)量）
1、ΔG值(自由能)反映了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度,。一般情況下,，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即5’端和中間ΔG值較高,，而3’端ΔG值相對(duì)較低,，且不要超過9（ΔG值為負(fù)值，這里取絕對(duì)值）,，如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯(cuò)誤引發(fā),。3′末端雙鏈的ΔG是0～－2 kcal/mol時(shí)，PCR產(chǎn)量幾乎達(dá)到百分之百,，隨著其絕對(duì)值的增加產(chǎn)量逐漸下降,，在－6時(shí)只有40%、到－8時(shí)少于20%,、而－10時(shí)接近于0,。 2、引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過4.5,，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶而且會(huì)降低引物濃度從而導(dǎo)致PCR 正常反應(yīng)不能進(jìn)行,，與二聚體相關(guān)的一個(gè)參數(shù)是堿基的分布，3’端的連續(xù)GGG 或CCC 會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā),。二聚體形成的能值越高越穩(wěn)定,，越不符合要求。與二聚體相同,，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好,。雖然有些帶有發(fā)夾環(huán)，其ΔG為－3 kcal/mol的自身互補(bǔ)引物也可以得到不錯(cuò)的結(jié)果,，但是如果它的3′末端被發(fā)夾環(huán)占據(jù)時(shí)就很麻煩,，即會(huì)引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參與正式反應(yīng)引物的數(shù)量。當(dāng)然,，如果發(fā)夾環(huán)在5′末端對(duì)反應(yīng)就沒有多大的影響了,。 補(bǔ)充三：關(guān)于產(chǎn)物需要測(cè)序的PCR引物的設(shè)計(jì)問題
在DNA測(cè)序的PCR中最好用5′末端穩(wěn)定(如GC含量較多)，而3′末端不太穩(wěn)定(如AT含量較多)的引物,，這種引物的結(jié)構(gòu)可以有效地消除假引發(fā)反應(yīng),。這就是基于引物內(nèi)部穩(wěn)定性的經(jīng)驗(yàn)之談。其3′末端穩(wěn)定性低的引物在這些反應(yīng)中能起好作用的原因在于,，接近或在3′末端上的堿基與非靶位點(diǎn)堿基所形成的配對(duì)的穩(wěn)定程度還不足以引發(fā)DNA合成,，所以不會(huì)產(chǎn)生假產(chǎn)物。因此,，為了有效地引發(fā)反應(yīng),，引物的5′末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反,，帶有穩(wěn)定的,、GC豐富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都與靶序列配對(duì),，只憑借其3′末端與靶序列任何位點(diǎn)的牢固配合就可以引發(fā)反應(yīng),，產(chǎn)生非專一產(chǎn)物。無論如何,，寡核苷酸3′末端最后5個(gè)核苷酸的穩(wěn)定性小于－9 kcal/mol的,，通常就是專一性的探針或引物。寡核苷酸3′末端越不穩(wěn)定,，假引發(fā)的可能性越低,。 以上內(nèi)容基本涵蓋了我設(shè)計(jì)引物的全部心得和體會(huì)，現(xiàn)在全部拿出來給大家分享,，希望對(duì)大家有所幫助,！ |
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