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【進(jìn)入正題】 前面提到的幾個(gè)探究蛋白互作相關(guān)的實(shí)驗(yàn),，其實(shí)第一步都需要構(gòu)建合適的質(zhì)粒,，那么就少不了設(shè)計(jì)靠譜的引物了。 通常來說,，引物的設(shè)計(jì)需要遵守一些基本的原則,。這些原則很細(xì)，很多，也很繁瑣,。但實(shí)際上對(duì)于常規(guī)的引物,，并不需要考慮太多，達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康募纯?，更多的情況下需要靈活選擇,。 一般來說，引物設(shè)計(jì)需要遵循以下原則： 1. 引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp,，常用的是18-27 bp,，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃,，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng),。 2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列,，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配,。引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC,，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加,。 3. 引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率,，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基,，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。另外,，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗,。5’端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物,。 4. 引物序列的GC含量一般為40-60%,，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大,。 5. 引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳,。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T),。 6. ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能,，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端ΔG值較低（絕對(duì)值不超過9）,，而5’端和中間ΔG值相對(duì)較高的引物,。引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng),。 7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶,，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行,。 8. 對(duì)引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點(diǎn),，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定,。 但是在實(shí)際設(shè)計(jì)過程中，往往很難同時(shí)滿足以上條件,，因此只需要在設(shè)計(jì)引物時(shí)盡可能滿足即可,，沒必要太過糾結(jié)。 同時(shí)需要注意,，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一,，具體情況需要具體看待。有的模板本身GC含量偏高或偏低,，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物,；在用作克隆目的的PCR因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低,。在這種情況只能退而求其次,，盡量去滿足條件。 下面主要介紹以下兩方面的引物設(shè)計(jì),。 1 點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì) 2 qPCR引物設(shè)計(jì) （常規(guī)引物的設(shè)計(jì)思路在已經(jīng)提到,，這里不再重復(fù)。） 1 點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì) 在蛋白質(zhì)功能研究過程中常常對(duì)其關(guān)鍵的酶活位點(diǎn),、修飾位點(diǎn)進(jìn)行突變,，通過點(diǎn)突變來研究基因中發(fā)揮關(guān)鍵功能的是哪一個(gè)結(jié)構(gòu)域，甚至具體到哪一個(gè)氨基酸,。因此就需要設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物,。 點(diǎn)突變主要的原則就是通過盡量突變較少的堿基數(shù)目而使氨基酸發(fā)生更改。由于氨基酸密碼子第三位具有簡(jiǎn)并性,，一般不需要進(jìn)行突變,，因此至多突變兩個(gè)堿基即可。  1.1單點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì) 比如,，將下圖中的Ser突變?yōu)?strong>Ala,。  首先，查詢編碼Ala的密碼子：為GCA/GCT/GCG/GCC,，根據(jù)改動(dòng)最小原則,，我們選擇將其突變?yōu)?strong>GCC，則只需要改動(dòng)1個(gè)堿基,，即TCC→GCC,。 設(shè)計(jì)引物（分兩種情況）： 情況一：構(gòu)建點(diǎn)突變質(zhì)粒 只需下面這一對(duì)引物即可。 F-S241A：TGTACACATTGTCACGGACGTACCCGCCGT R-S241A：ACGGCGGGTACGTCCGTGACAATGTGTACA 可以看到黃色部分為需要突變的氨基酸,，紅色的堿基為突變堿基,，兩邊各延長(zhǎng)一部分完全與模板互補(bǔ)配對(duì)的堿基。 但是發(fā)現(xiàn)兩條引物完全互補(bǔ)配對(duì)，看似違反了前面所講的原則,，但實(shí)際上是針對(duì)質(zhì)粒點(diǎn)突變精妙的設(shè)計(jì),。兩條引物有一定幾率與模板匹配，此時(shí)便會(huì)按5'-3’方向完整擴(kuò)增一圈整個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒,，最終形成突變質(zhì)粒的構(gòu)建,。 情況二：只對(duì)目的基因進(jìn)行點(diǎn)突變 則除了需要情況一中的兩條引物，還需要在目的基因兩端選取F和R,。如下圖：  1.2同時(shí)對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變 針對(duì)單點(diǎn)突變,，手動(dòng)選取即可完成，但對(duì)于多位點(diǎn)突變就不能蠻干了,。這里分享一個(gè)在線點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)的網(wǎng)址： https://www.agilent.com/store/primerDesignProgram.jsp該網(wǎng)站可以設(shè)計(jì)單點(diǎn)和多點(diǎn)突變引物以及刪除或者插入一段DNA序列（ 插入時(shí)只能插入小的DNA片段）,。可以同時(shí)設(shè)計(jì)針對(duì)7個(gè)氨基酸的突變引物,。 進(jìn)入頁面：  參數(shù)說明：   比如,，我們對(duì)以下3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變。  從結(jié)果可以看到引物的長(zhǎng)度,、Tm值及引物與模板相互匹配的序列,。  1.3缺失一段序列 比如缺失下圖中67-114之間的序列，（注意：第67位和114位這兩個(gè)氨基酸不會(huì)被刪除,，實(shí)際刪除66-113這段氨基酸序列）,。   小結(jié)：一般在單點(diǎn)突變和缺失一段序列時(shí)，成功率比較高,；多點(diǎn)突變時(shí)可能就需要多次嘗試并檢測(cè)了,。 2 qPCR引物設(shè)計(jì) Q：qPCR引物設(shè)計(jì)的問題點(diǎn)： A：SYBR Green與雙鏈DNA結(jié)合后會(huì)產(chǎn)生熒光，如果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增或者引物二聚體存在,，也將被檢測(cè)到,，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確。 因此設(shè)計(jì)合適的qPCR引物就很關(guān)鍵,。 qPCR引物設(shè)計(jì)的一般原則： 引物應(yīng)在核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性,。 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在80-150 bp。最長(zhǎng)不要超過300 bp,。 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu),。 引物長(zhǎng)度：一般在17-25堿基之間，上下游引物不宜相差太大,。 引物自身避免形成發(fā)卡結(jié)構(gòu),。 引物之間避免形成引物二聚體。 引物 G+C含量在40%～60%之間,，45-55％最好,。 引物Tm值在58-62度之間,，上下游引物Tm值不宜相差太大，最好不要超過5度,。 其實(shí)這里qPCR引物的設(shè)計(jì)和常規(guī)PCR的設(shè)計(jì)也是大同小異,。和常規(guī)引物設(shè)計(jì)一樣，并不能死磕原則,，靈活選擇更為重要,。 這里可以使用以下軟件和在線網(wǎng)站進(jìn)行設(shè)計(jì)： 1.Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)方法和常規(guī)引物設(shè)計(jì)一樣,，只需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)置幾個(gè)必要參數(shù)即可,。這里不進(jìn)行演示。 2.NCBI Primer blast： 3.Primer3： https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/下面對(duì)NCBI Primer blast和Primer3進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹,。 NCBI Primer blast 同樣,，我們選擇P53這個(gè)基因。點(diǎn)擊Pick Primer進(jìn)入NCBI Primer blast界面,。  可以看到,，上一步選擇的p53序列已經(jīng)加載進(jìn)來。 接下來看一下界面中幾個(gè)重要的參數(shù)設(shè)置,。 結(jié)果如下： 最后,，選擇最優(yōu)引物即可。 Primer3 Primer3屬于傻瓜式操作,，各參數(shù)已自動(dòng)設(shè)定,，基本無需更改，粘貼序列后直接提交即可,。 但這里需要思考一個(gè)問題： 是否排名第一的引物對(duì)一定最優(yōu)呢,？不一定。由于這些引物是未考慮非特異性擴(kuò)增的,。因此在得到候選引物對(duì)后,，最好還是靈活選擇。以便得出最優(yōu)的引物對(duì),，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,。 除了上述在線網(wǎng)址外，給大家推薦以下軟件和在線網(wǎng)址,，助力解決點(diǎn)突變,、qPCR等引物設(shè)計(jì)的各種問題。具體的使用問題各位可以自行摸索,，都很簡(jiǎn)單,，基本上打開就可以使用 1.BioXM 2.http://www./primerx/index.htm 3.https://biodb./qprimerdb/ （qPCR引物數(shù)據(jù)庫qPrimerDB，收錄了包括66種重要植物（擬南芥,、水稻,、玉米,、大豆、馬鈴薯等）等在內(nèi)的147個(gè)物種共3331426個(gè)基因的51091785對(duì)qPCR引物,。） |
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