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01前言 新使生物推出多聚核糖體分析(Polysomeprofiling)，引進(jìn)Biocomp全自動(dòng)密度梯度制備與核糖體分選一體機(jī),，制備蔗糖密度梯度分離多聚核糖體,，繪制多聚核糖體圖譜，適用于哺乳動(dòng)物,、植物及真菌等多物種樣品類型的分析,。 Polysome profiling技術(shù)是基于蔗糖濃度梯度溶液超離心，將細(xì)胞質(zhì)RNA分離成多個(gè)組分：游離RNA,，結(jié)合核糖體40S或60 S亞基,、單核糖體(80S亞基)或多聚核糖體等。一條翻譯的mRNA可同時(shí)結(jié)合多個(gè)核糖體,，結(jié)合核糖體組分的RNA與總胞質(zhì)RNA的比例可以間接反映翻譯水平,。 02技術(shù)原理 一般來說，翻譯越旺盛,，結(jié)合在一條mRNA上的核糖體數(shù)量就越多,，蔗糖梯度離心時(shí)的沉降速率越快，因此可以通過沉降系數(shù)的差異將結(jié)合不同數(shù)量核糖體的mRNA通過離心進(jìn)行分離,，比較不同組分中蛋白和轉(zhuǎn)錄本的差異,。 03技術(shù)優(yōu)勢(shì) 適用多物種：哺乳動(dòng)物細(xì)胞/組織、植物,、真菌 04實(shí)驗(yàn)步驟 Polysome profiling步驟 ① 裂解：添加延伸抑制劑,，以防止核糖體脫離mRNA,，在增殖階段裂解細(xì)胞，從總細(xì)胞裂解物中分離細(xì)胞質(zhì)組分,； ② 超離：將細(xì)胞質(zhì)裂解液加到蔗糖梯度溶液中,，超速離心將RNA分離成不同密度的組分； ③ 組分分離：將離心后的樣品紫外線(UV)檢測(cè)器的專用儀器上,，并與密度梯度溶液制備和收集系統(tǒng)等分離系統(tǒng)耦合,，分離并獲得各個(gè)組分； ④ 提取RNA：從蔗糖組分中回收RNA,； ⑤ 組分分析 ●針對(duì)單一或幾個(gè)目標(biāo)RNA利用RT-qPCR分析各組分的目標(biāo)RNA分布,； ●利用Western Blot或質(zhì)譜研究必需的翻譯蛋白調(diào)節(jié)因子； ●從分離得到的組分中,，選取感興趣的組分,，通過高通量的RNA-seq分析基因組規(guī)模的翻譯（擴(kuò)展為Polysome-seq技術(shù)）。 05技術(shù)局限 Polysome profiling技術(shù)局限 ① 需專門設(shè)備在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室可能無法獲得,； ② 需要樣本量較大,，因?yàn)樵跇悠贩蛛x過程中，從多個(gè)蔗糖組分中合格RNA的回收率較低,。 |
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