1,、引物長度一般在15-30bp。常用的為18-27bp,，但不應(yīng)大于38bp,，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng),；

    2,、引物GC含量一般為40%-60%， 45-55%為宜,，GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng),。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

    3,、引物所對應(yīng)的模板序列的Tm值最好在72℃左右,。至少要在55-80℃之間。

    4,、引物3’端的堿基一般不用A,。A在錯誤引發(fā)位點的引發(fā)效率相對比較高。引物3’端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基,，如GGG或CCC,，或者引物3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗,。

    5,、堿基要隨機(jī)分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ),。

    6,、 盡量在Exon junction上設(shè)計引物，限制基因組DNA擴(kuò)增,。

    7,、 使用BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性