引物設(shè)計(jì)道理聽了很多，依然做不好一個(gè)引物設(shè)計(jì),？你需要的是實(shí)戰(zhàn)演習(xí),！廢話不多說，案例搬上來：

1）首先在NCBI中輸入基因

2）點(diǎn)擊進(jìn)入

3）找到該基因的mRNA序列

4）點(diǎn)擊進(jìn)入,，在右邊可看到Pick Primer

5）點(diǎn)擊Pick Primer，進(jìn)入引物設(shè)計(jì)界面,，系統(tǒng)自動(dòng)把該基因的序列輸入到了里面,，也可以把你任何想要設(shè)計(jì)引物的序列輸入到對(duì)應(yīng)的框中,，設(shè)計(jì)針對(duì)該序列的引物

6）將擴(kuò)增產(chǎn)物大小設(shè)置為100-150

7）點(diǎn)擊下方的Get Primer

8）選擇并提交

9）提交后即可得到引物序列

10）根據(jù)引物設(shè)計(jì)的原則篩選合適的引物

1）擴(kuò)增產(chǎn)物長度100 bp-150 bp為佳；

2）引物長度17 bp-25 bp最好,；

3）正向引物和反向引物的Tm值最好相差不要超過1℃,。Tm值調(diào)整至60℃-65℃為佳；

4）引物的GC含量控制在40%-60%之間,，最佳為45%-55%,；

5）引物3'末端堿基最好為G或C或A，避免使用T,；

6）避開引物內(nèi)部或者兩條引物之間有3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列,，二條引物之間的3'端避開有2個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列；

7）引物A,、G,、C、T整體分布盡量要均勻,，避免使用GC或者TA含量高的區(qū)域,，尤其是3'端，必須避開GC含量不均勻的區(qū)域,；

8）最好跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物。