編譯：小北,，編輯：景行、江舜堯,。

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原名：A large-scale binding and functional map of human RNA-binding proteins

譯名：人類RNA結(jié)合蛋白的大規(guī)模結(jié)合及功能圖

期刊：Nature

IF：42.778

發(fā)表時(shí)間：2020年7月

通訊作者：Brenton R. Graveley，Gene W. Yeo

通訊作者單位：加利福尼亞大學(xué)

DOI號(hào)：10.1038/s41586-020-2077-3

為了更好的理解人類RBP的結(jié)合和功能,，研究者利用五種方法針對(duì)于356個(gè)RBPs,，產(chǎn)生了1223個(gè)可復(fù)制的數(shù)據(jù)集。這些RBPs參與RNA生物學(xué)的多個(gè)方面并且包含不同的序列和結(jié)構(gòu)特征,。從功能上而言,，這些RBPs大多參與調(diào)節(jié)RNA剪接(98 RBPs， 28%),，并且162 RBPs (46%)已經(jīng)報(bào)道含有多個(gè)功能,，但是83 (23%)尚未證實(shí)RNA的功能機(jī)制（圖1b）。盡管57%的RBPs包含已經(jīng)確定的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,，剩余的包括研究較少的結(jié)構(gòu)域或者尚不知曉的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（圖1b）,。一些RBPs，包括核糖體蛋白R(shí)PL23A和剪接體因子HNRNPC在ENCODE細(xì)胞系和一系列人類組織中高表達(dá),，但是一些的表達(dá)具有組織特異性,，表明這些RBPs的調(diào)節(jié)活性可能通過細(xì)胞類型特異的基因表達(dá)程序調(diào)節(jié)。五種方法中的每一種都聚焦于RBP活性的不同方面（圖1a）,，如下所述,。

圖1. 對(duì)實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)類型回顧。（a）區(qū)分RBPs的五種實(shí)驗(yàn),；（b）至少通過一組ENCODE實(shí)驗(yàn)（黃色或者紅色）,，結(jié)合免疫熒光（綠色）、CRISPR篩選的重要基因（栗色）、手動(dòng)注釋的RBP功能（藍(lán)色或者紫色）以及蛋白結(jié)構(gòu)域的注釋繪制356個(gè)RBPs,，每一類別的直方圖如下所示,；（c）PTBP3的組合表達(dá)以及剪接調(diào)節(jié)。

2  RBPs的全轉(zhuǎn)錄組RNA結(jié)合位點(diǎn)

研究者鑒定并證實(shí)數(shù)以百計(jì)IP級(jí)別的抗體能夠識(shí)別人類RBPs,，并且開發(fā)了eCLIP,。研究者分別對(duì)K562細(xì)胞中120個(gè)RBPs以及HepG2細(xì)胞中103個(gè)RBPs進(jìn)行了高質(zhì)量的eCLIP圖譜繪制。該項(xiàng)工作鑒定了844854個(gè)差異富集的峰圖,，涵蓋了18.5%個(gè)注釋的mRNA轉(zhuǎn)錄以及2.6%個(gè)mRNA前體的轉(zhuǎn)錄組,。

3  RBP應(yīng)答的基因和選擇性剪接事件

為了探究eCLIP峰圖的功能，研究者利用shRNA或者CRISPR對(duì)個(gè)體RBPs進(jìn)行敲除,，隨后進(jìn)行RNA-seq,。研究者分別在K562細(xì)胞中敲除了235個(gè)RBPs，在HepG2細(xì)胞中敲除了237個(gè)RBPs,，與配對(duì)的非靶向?qū)φ諗?shù)據(jù)集相比,，在20542個(gè)基因中鑒定出375，873個(gè)差異表達(dá)基因的事件在至少一個(gè)RBP敲除后受到影響,，以及221,，612個(gè)差異剪接體事件，包含38,，555個(gè)選擇性剪接事件在至少一個(gè)RBP敲除時(shí)受到影響,。進(jìn)一步分析證實(shí)在一些數(shù)據(jù)集中GC對(duì)read密度的影響可通過Salmon和CAN工具校正。除了每個(gè)實(shí)驗(yàn)的批次對(duì)照,，批次校正能夠?qū)φ麄€(gè)數(shù)據(jù)集整合分析,。

4  體外RBP結(jié)合基序

研究者利用帶有重組純化RBPs的RBNS以及隨機(jī)RNA寡核苷酸的工具對(duì)體外78個(gè)RBPs進(jìn)行了RNA序列和結(jié)構(gòu)結(jié)合的鑒定。研究者在接近半數(shù)的RBPs (37 of 78)中鑒定五個(gè)核苷酸(nt) (k = 5)高度富集的k-mers,，并且聚類為單一的基序,。剩余的RBPs具有更加復(fù)雜的結(jié)合圖譜，由兩個(gè)基序(32 of 78),，或者三個(gè)或者更多的基序(9 RBPs),。這些結(jié)果提示一些RBPs對(duì)包含基序的序列和RNA結(jié)構(gòu)是敏感的。

5  RBPs的亞細(xì)胞定位

為了闡釋細(xì)胞空間內(nèi)RBPs的功能特性,，研究者利用已經(jīng)證實(shí)的抗體分別對(duì)HepG2細(xì)胞中274個(gè)RBPs以及HeLa細(xì)胞中268個(gè)RBPs進(jìn)行了系統(tǒng)的免疫熒光成像,，發(fā)現(xiàn)它們與特異細(xì)胞器和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中12個(gè)標(biāo)記物結(jié)合。這些數(shù)據(jù)包括217,，412個(gè)圖像并且采用詞匯定位描述符,，被收錄在RBP圖像數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://rnabiology.ircm./RBPImage/)。

6  RBPs與染色質(zhì)結(jié)合

為了研究RBP與染色質(zhì)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄和共轉(zhuǎn)錄剪接中的作用,，研究者進(jìn)行了ChIP-seq實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了37個(gè)RBPs相關(guān)聯(lián)的DNA元件資源,，這些實(shí)驗(yàn)確定了792,，007個(gè)ChIP-seq的峰圖，占基因組的3.8%,。

7  數(shù)據(jù)整合分析

為了進(jìn)行整合分析,，每個(gè)數(shù)據(jù)類型中的所有數(shù)據(jù)都通過相同的數(shù)據(jù)加工管道，并且所有試驗(yàn)中數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)都是一致的,。研究者利用至少兩種不同的方法研究了70%的RBPs,，并且利用至少三種方法對(duì)129 (37%)個(gè)RBPs進(jìn)行了分析，利用多個(gè)數(shù)據(jù)集實(shí)現(xiàn)了整合分析,，例如PTBP1調(diào)節(jié)PTBP3（圖1c）,。PTBP3的mRNA包含外顯子2改變了起始密碼子的使用并且增加了PTBP3蛋白的細(xì)胞質(zhì)定位，在對(duì)照細(xì)胞中PTBP3外顯子2缺失,，但是在PTBP1敲低的條件下增加，這與之前的報(bào)道一致,。剪接事件可能受PTBP1的直接調(diào)節(jié),，正如研究者在PTBP3外顯子2的3’端剪接位點(diǎn)的eCLIP的峰圖一致，在RBNS中富含U的基序與PTB家族相連,。研究者也發(fā)現(xiàn)了與PTBP3外顯子10之間的強(qiáng)相互作用,，沒有表現(xiàn)出選擇性剪接，但是是與PTBP1外顯子10和PTBP2外顯子11是直系同源的,，以PTBP1和PTBP2介導(dǎo)的方式選擇性剪接,，從而引發(fā)無意義的mRNA衰減。因此通過PTBP1介導(dǎo)的PTBP3外顯子10的剪接并不是由于PTBP1不結(jié)合導(dǎo)致的,。在另一個(gè)案例中,，研究者觀察到GTPBP2隱顯子HNRNPL下游的富集包含首個(gè)HNRNPL RBNS基序的重復(fù)，表明HNRNPL抑制外顯子的剪接,，并且對(duì)帶有全長(zhǎng)開放閱讀框的GTPBP2 mRNA的產(chǎn)生發(fā)揮重要作用,。

8  eCLIP數(shù)據(jù)組的分析

研究者進(jìn)行了488例eCLIP實(shí)驗(yàn)，每一例都包含生物學(xué)重復(fù)的IPs以及一個(gè)配對(duì)的且大小匹配的input,?；贗P驗(yàn)證、文庫(kù)產(chǎn)量,、重現(xiàn)峰的存在或重復(fù)家族信號(hào),、基序富集(已知結(jié)合的RBPs) 以及已經(jīng)建立的生物學(xué)功能對(duì)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，獲取了223個(gè)高質(zhì)量的eCLIP數(shù)據(jù)組,，并且發(fā)布在了ENCODE數(shù)據(jù)協(xié)調(diào)中心(https://www.),。另外50個(gè)數(shù)據(jù)組由于不符合嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)并不包含在進(jìn)一步分析中，但是包含可重復(fù)的信號(hào)（GSE107768）,。自動(dòng)量化的標(biāo)準(zhǔn)也能準(zhǔn)確的劃分83% eCLIP數(shù)據(jù)組的質(zhì)量,。通過手動(dòng)而非自動(dòng)質(zhì)量評(píng)估的數(shù)據(jù)組有特殊的注釋,。盡管研究者觀察到嚴(yán)格的IP洗滌條件通常限制了非直接相互作用的回收，在本研究中eCLIP實(shí)驗(yàn)并不包括蛋白相關(guān)RNA的可視化,，因此能夠通過比對(duì)體外基序單獨(dú)證實(shí)eCLIP圖譜,，并且敲低后效應(yīng)的改變也能證實(shí)真實(shí)的結(jié)合作用。

標(biāo)準(zhǔn)的CLIP-seq分析通常能夠鑒定成千上萬個(gè)read密度富集的集簇,。然而,，研究者在之前的研究中發(fā)現(xiàn)IP vs input實(shí)驗(yàn)中所需要的富集通過移除轉(zhuǎn)錄本中非特異的信號(hào)特異的證實(shí)了生物學(xué)相關(guān)的峰圖。因此,，盡管所有集簇中的數(shù)據(jù)都只經(jīng)過IP分析證實(shí),，在本研究中研究者所需要的峰圖需要符合相對(duì)于input富集的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)(富集倍數(shù) ≥8，P ≤ 0.001),。研究者進(jìn)一步利用不可復(fù)制發(fā)現(xiàn)率(IDR)方法對(duì)生物學(xué)重復(fù)中特異的峰圖進(jìn)行了重復(fù)驗(yàn)證,。最終，研究者將57個(gè)“黑名單”區(qū)域中重疊的峰圖進(jìn)行了移除,，結(jié)果與人造信號(hào)一致,。下游樣本分析提示在低表達(dá)基因中標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序深度下也能夠檢測(cè)到峰圖。當(dāng)研究者將峰圖疊加到GENCODE轉(zhuǎn)錄本注釋中時(shí),，大多數(shù)RBPs的峰圖與特異的區(qū)域重疊,，與之前鑒定的RBPs功能是一致的（圖2a）?；谥饕D(zhuǎn)錄本區(qū)域結(jié)合的類型,，研究者將這些RBPs聚類稱6個(gè)RNA類型，為后續(xù)基于峰圖的分析提供了參考比對(duì)（圖2a）,。根據(jù)觀察一些eCLIP數(shù)據(jù)組中特異匹配的read代表總數(shù)的一小部分,，研究者開發(fā)了一種家庭意識(shí)的映射策略，能夠?qū)Χ嗫截愒系南鄬?duì)富集進(jìn)行準(zhǔn)確的定量,，包括多個(gè)假基因的基因家族,、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子以及其他重復(fù)元件。結(jié)合這種方法,，研究者觀察到與已知功能一致的rRNA或者snRNA信號(hào)調(diào)控的RBPs集簇,，以及與反義Alu以及L1/LINE信號(hào)介導(dǎo)的集簇（圖2b、c）,，與近期的分析一致,，與逆轉(zhuǎn)座元件結(jié)合包含RBP結(jié)合圖譜中被忽視的一部分。

圖2. RBP-靶基因相互作用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的整合分析,。（a）堆積的條形圖提示223個(gè)eCLIP實(shí)驗(yàn)中顯著的eCLIP峰圖,，峰圖的數(shù)量在對(duì)數(shù)范圍，條形圖的高度依據(jù)與pre-RNA,、mRNA以及非編碼RNAs重疊的線性部分標(biāo)注,，數(shù)據(jù)集依據(jù)相同區(qū)域圖譜層次聚類為6個(gè)集簇,；（b）針對(duì)223個(gè)eCLIP實(shí)驗(yàn)中特異的基因組以及多拷貝元件信號(hào)的t-SNE聚類，分為17個(gè)集簇和一個(gè)RBPs的離群值,；（c）熱圖顯示圖B中RBPs集簇,，提示每個(gè)RNA區(qū)域或者元件中平均相關(guān)信息；（d）每個(gè)點(diǎn)代表在K562細(xì)胞中RBFOX2 eCLIP對(duì)應(yīng)HepG2細(xì)胞中可重復(fù)的RBFOX2 eCLIP峰圖的富集倍數(shù),；（e）在K562和HepG2細(xì)胞中繪制的每個(gè)RBP,。

9  RBP元件的發(fā)現(xiàn)飽和

盡管大多數(shù)表達(dá)的基因都表現(xiàn)為差異表達(dá)并且至少在一個(gè)數(shù)據(jù)集中有eCLIP峰圖，只有5214個(gè)基因具有來自同一個(gè)RBP的eCLIP峰圖并且對(duì)該RBP的敲除應(yīng)答,，提示大部分基因敲除的應(yīng)答改變是間接效應(yīng)的結(jié)果,。選擇性剪接反應(yīng)了更大的可變性，由RNA解旋酶和剪接體蛋白AQR的敲除鑒定出13000個(gè)剪接改變,。單獨(dú)考慮eCLIP,，在至少一個(gè)峰圖上可以發(fā)現(xiàn)3.4%內(nèi)含子序列以及33.5%外含子序列，盡管一些峰圖反映了蛋白質(zhì)包裹或者短暫的與RNAs結(jié)合,，例如與RNA聚合酶II的成分POLR2G與pre-mRNAs 之間相互作用,，而不是RNA加工過程調(diào)節(jié)位點(diǎn)。

接下來,，研究者探究了RBP的調(diào)節(jié)是否在不同細(xì)胞類型中一致,。研究者在HepG2細(xì)胞中觀察到如果整體靶向RNA的表達(dá)在5的因子內(nèi),，RBFOX2 eCLIP的峰圖在K562細(xì)胞中富集（圖2d）,。將這一觀察拓展到兩種細(xì)胞系中全部73個(gè)RBPs的eCLIP數(shù)據(jù)匯總，在未改變的或者中度差異表達(dá)的基因內(nèi)大多數(shù)峰圖在第二種細(xì)胞系中四倍甚至更多倍的富集,，并且在其他細(xì)胞類型中與重現(xiàn)且顯著的峰圖重疊（富集倍數(shù)≥8,， P ≤ 0.001）（圖2e）。相反,，46.3%RBP峰圖的平均值在第二種細(xì)胞系細(xì)胞類型特異表達(dá)的基因上沒有富集,，而只有21.6%的發(fā)生在未改變、微弱或者適中差異表達(dá)的基因上,。因此,，這些結(jié)果表明大多數(shù)RBP的eCLIP信號(hào)在細(xì)胞系相似基因的表達(dá)上是保守的，而峰圖的差異往往反映了細(xì)胞類型特異的RNA表達(dá)而不是差異結(jié)合,。

10 體外的特異性驅(qū)動(dòng)了體內(nèi)的結(jié)合

體內(nèi)RBP的結(jié)合是由RNA內(nèi)在的結(jié)合特異性以及其他因素,，例如RNA結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的輔因子決定的。為了比較體外和體內(nèi)的特異性,，研究者計(jì)算了RBNS結(jié)合序列中每5mer的原始富集（R值）,，并且與eCLIP峰圖(ReCLIP)中對(duì)應(yīng)的富集進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)聚焦于5mers是因?yàn)樗鼈兪亲钬S富的,，且大多數(shù)蛋白經(jīng)過RBNS包含的RNA識(shí)別基序(RRM)或者h(yuǎn)nRNP K同源（KH）結(jié)構(gòu)域分析,，它們與RNA的3-5個(gè)堿基相連,。在體內(nèi)和體外顯著富集的5mers大都是一致的，有15/23個(gè)RBPs顯著重疊（圖3a）,。一個(gè)RBP的首個(gè)RBNS 5mer幾乎富集在eCLIP峰圖上（圖3a）,，并且相較于相同RNA類型中其他RBPs的eCLIP峰圖，RBNS基序能夠更多對(duì)應(yīng)的eCLIP峰圖,。在大多數(shù)案例中,，在編碼區(qū)、內(nèi)含子區(qū)域或者UTR區(qū)域的eCLIP峰圖觀察到了相似的結(jié)果（圖3a）,。顯著的是,，單一最富集的RBNS 5mer出現(xiàn)在30%的RBPs峰中，包括SRSF9,， TRA2A,， RBFOX2， PTBP3,， TIA1,，HNRNPC，并且近一半的eCLIP峰圖包含前五個(gè)RBNS 5mers中的一個(gè)（圖3a）,。因此這些5mers的案例提供了候選的核苷酸分辨結(jié)合位點(diǎn),，能夠預(yù)測(cè)改變RNA加工過程的遺傳變異。當(dāng)在RBNS和eCLIP中有兩個(gè)或者更多不同的基序富集時(shí),，大部分體外富集的基序通常也在體內(nèi)富集,。這些結(jié)果與那些研究中稱RBPs包含更多單鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的觀點(diǎn)是一致的。內(nèi)在的結(jié)合特異性解釋了很大一部分體內(nèi)結(jié)合的傾向,。

對(duì)于近一半的RBPs（10/23）,，前5個(gè)RBNS 5mers闡釋了少于一半的eCLIP峰圖。這些RBPs中的一些與RNA結(jié)構(gòu)特征相關(guān)或者延伸RNA序列元件,，而其他的可能通過相互作用的蛋白連接,。在一些案例中，RBNS只和一小部分富集在eCLIP峰圖上的基序有親和性,，例如C富集的6mers主要富集在PCBP2的RBNS數(shù)據(jù)以及PCBP2的eCLIP峰圖上（圖3b）,，但是也有一部分eCLIP富集的kmers并不通過RBNS富集（圖3b）。這種“只有eCLIP”的基序通常G-,， GC-,，或者GU-富集，可能代表RNA與其他蛋白的結(jié)合或者代表在共純化或交聯(lián)位置或接近交聯(lián)位點(diǎn)的序列偏差,。

在PCBP2的案例中,，C富集的（RBNS）基序而不是G富集的（只有eCLIP）基序在鄰近PCBP2調(diào)節(jié)的外顯子上富集，提示RBNS基序可能幫助證實(shí)某個(gè)eCLIP的峰圖與因子特異的調(diào)節(jié)相對(duì)應(yīng),。考慮到RBPs與eCLIP，RBNS以及KD-RNA-seq數(shù)據(jù),，靠近選擇性的外顯子上eCLIP富集與18/28個(gè)已知剪接調(diào)節(jié)RBPs敲低后剪接改變?cè)龆嘞嚓P(guān)。為了探究序列特異結(jié)合和調(diào)節(jié)之間的關(guān)系,，研究者將eCLIP峰圖中包含(RBNS+)或者缺乏(RBNS–)最高親和性的RBNS基序進(jìn)行分類。在外顯子區(qū)域,，RBNS+ eCLIP峰圖與外顯子跳躍收到強(qiáng)抑制有關(guān),，包含RBNS–的峰圖外顯子約有25%的升高（圖3c）。因此,，能夠反映體外結(jié)合序列特異性的eCLIP峰圖賦予了更強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用,，可能是因?yàn)樗鼈兇淼南嗷プ饔酶映志谩Ｍㄟ^首個(gè)只有eCLIP的5mer存在或者缺失對(duì)eCLIP峰圖分離,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在剪接調(diào)節(jié)活性方面具有微小的差異,。與RBP抑制的外顯子不同，RBP激活的外顯子在RBNS+和RBNS–的峰圖之間只有在內(nèi)含子區(qū)域的下游有一個(gè)微弱的顯著差異(P < 0.02),，而在其他地方?jīng)]有顯著差異,。是否在RBP抑制的而不是RBP激活的外顯子上有一個(gè)更強(qiáng)的效應(yīng)尚不清楚，可能更加持久的結(jié)合對(duì)于剪接抑制而不是激活更加關(guān)鍵,。

圖3. 體內(nèi)序列特異性的結(jié)合主要是由RBPs的內(nèi)在RNA親和力決定的,。（a）RBNS-和eCLIP富集5mers的首個(gè)序列基序，依據(jù)RBNS與eCLIP富集的相關(guān)性降低排序,。填充的圓圈提示RBNS與eCLIP基序顯著富集,。左邊的熱圖表示所有5mers RBNS和eCLIP富集之間的斯皮爾曼相關(guān)性，中間的熱圖表示不同基因區(qū)域eCLIP峰圖中首個(gè)RBNS 5mer富集,，右邊的熱圖表示eCLIP峰圖的比例歸因于10個(gè)最高親和力RBNS 5mers中的每一個(gè),，以及RBNS 5mers 11–24的結(jié)合,；（b）比較體內(nèi)vs體外5mer富集的PCBP2,，以及包含CCCC和GGGG的5mers；（c）在RBP敲除后比較剪接的改變,。

11  RBP靶向的功能特征

對(duì)KD–RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析使得研究者對(duì)eCLIP鑒定的RNA元件進(jìn)行了功能推斷,。研究者首先鑒定了RBP KD–RNA-seq中對(duì)轉(zhuǎn)錄本豐度的顯著變化，因?yàn)閷?duì)RNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)可以改變穩(wěn)定的mRNA水平,。為了證實(shí)RNA穩(wěn)定性的潛在調(diào)節(jié)因子,，研究者將RBP敲除后在eCLIP富集的5′UTRs、CDSs以及3′UTRs的差異基因進(jìn)行了比較,。盡管與標(biāo)準(zhǔn)的DESeq分析比較,，KD-RNA-seq具有更多與eCLIP富集的顯著重疊，研究者發(fā)現(xiàn)從與RNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)相關(guān)的序列偏差的文庫(kù)制備中很難解決基因水平GC含量的偏差,。因此研究者進(jìn)行了一項(xiàng)保守的分析,，利用Salmon以及CQN工具對(duì)KD-RNA-seq倍數(shù)改變的潛在GC含量的偏差進(jìn)行了完全的清除,。研究者鑒定出了4個(gè)RBPs在eCLIP富集和敲除后表達(dá)升高之間存在相關(guān)性，有7個(gè)RBPs的eCLIP峰圖與表達(dá)降低相關(guān)（圖4a）,。當(dāng)與同一結(jié)合類的RBPs比較時(shí)（圖2a）,，靶向的RBP在5/11案例中具有最大的富集，并且用于大多數(shù)比較,。

在RBP敲除后RBPs的eCLIP與靶基因的表達(dá)升高相關(guān)也包括之前鑒定的RNA衰減因子（如DDX6）,，在敲除后RBPs的eCLIP和表達(dá)降低相關(guān)包括IGF2BP3和FMR1，在之前的報(bào)道中稱能夠提高RNA靶基因的穩(wěn)定性（圖4c）,。除了這11個(gè)RBPs,，其他的例如UPF1在更高的eCLIP富集中止時(shí)顯著相關(guān)（圖5e），暗示更復(fù)雜的模型可能顯示更多的重疊,。

圖4. 敲除后RBP結(jié)合和RNA表達(dá)之間的相關(guān)性,。（a）熱圖說明RBP敲除的RNA-seq實(shí)驗(yàn)中，基因顯著富集的區(qū)域與顯著升高或者降低基因之間顯著重合,；（b-c）線條表示HepG2細(xì)胞中DDX6 eCLIP富集以及HepG2中IGF2BP3 eCLIP富集基因表達(dá)倍數(shù)變化的累積分布,。

12  RBP與剪接調(diào)節(jié)相關(guān)

RBP與外顯子結(jié)合能夠調(diào)節(jié)包含或者排除外顯子或者5′或者3′選擇性剪接位點(diǎn)。為了探究RBP富集如何與剪接調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián),，研究者通過比較細(xì)胞中RBPs敲除后的RNA-seq數(shù)據(jù)鑒定了所有顯著的選擇性剪接事件,。接下來研究者在每個(gè)RBP中構(gòu)建了一個(gè)RNA剪接圖譜，利用自定義的方法對(duì)元-外顯子上敲除響應(yīng)的剪接事件的eCLIP富集取平均,，對(duì)配對(duì)的input進(jìn)行整合,。在近內(nèi)含子下游RBFOX2 eCLIP的富集與RBP敲除外顯子外以及近內(nèi)含子上游PTBP1富集相關(guān)（圖5a），與之前的報(bào)道RBFOX2和PTBP1基序的富集以及CLIP的結(jié)合相一致,。在同一細(xì)胞系中203對(duì)eCLIP和KD–RNA-seq,，研究者發(fā)現(xiàn)外顯子、3′選擇性剪接以及5′選擇性剪接事件中的各種RNA圖譜,。SR蛋白的結(jié)合與敲除后外顯子的降低相關(guān),，而hnRNP蛋白與外顯子的升高相關(guān)，與經(jīng)典的模型中SR和hnRNP蛋白對(duì)剪接具有拮抗效應(yīng)相關(guān)（圖5b）,。當(dāng)研究者比較不同細(xì)胞系中同一RBP的數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn)了更高的剪接圖譜相關(guān)性,。重要的是，一些剪接體的RBPs具有不同的剪接圖譜,，表明剪接體停留的時(shí)間與敲除后的敏感性之間的關(guān)聯(lián)需要進(jìn)一步被探索,。對(duì)于非剪接體的RBPs，RBP的關(guān)聯(lián)性在外顯子邊界的內(nèi)含子區(qū)域更高,，這與之前的報(bào)道選擇性事件對(duì)單個(gè)RBPs的剪接調(diào)節(jié)更加敏感是一致的,。值得注意的是，上游5’剪接位點(diǎn)的富集程度顯著高于選擇性外顯子側(cè)的內(nèi)含子區(qū)域（圖5c），表明外顯子上游的內(nèi)含子的5 '剪接位點(diǎn)表示一個(gè)剪接體的調(diào)節(jié)未被充分認(rèn)識(shí)的區(qū)域,。

作為一個(gè)額外的對(duì)照,，研究者將同一RNA類型中所有eCLIP數(shù)據(jù)集每個(gè)敲除數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，并且發(fā)現(xiàn)相似的剪接圖譜,。盡管一些RBPs僅在同一RBP中富集,，其他的提示具有潛在的共調(diào)節(jié)作用。例如,，QKI在RBFOX2敲除外的外顯子中eCLIP富集（圖5d,、e），并且與敲除RBFOX2或者QKI后剪接體的改變顯著相關(guān),，與之前在SKOV3ip1卵巢癌細(xì)胞中觀察到的結(jié)果一致,。這些結(jié)果反映了復(fù)雜的協(xié)調(diào)是由于RBFOX2和QKI很少在同一內(nèi)含子具有富集的eCLIP信號(hào)。相反,，TIA1和TIAL1在TIA1敲除誘導(dǎo)的外顯子上具有重疊的富集圖譜,，盡管與其他因子沒有co-IP，這與之前對(duì)TIA1和TIAL1的研究是一致的,。然而,，TIA1和TIAL1敲除后對(duì)應(yīng)的外顯子與剪接體的改變沒有關(guān)聯(lián)，暗示結(jié)合的調(diào)節(jié)效應(yīng)在這些位點(diǎn)可能不是共有的,。

圖5. eCLIP 和RNA-seq整合鑒定剪接調(diào)控圖譜,。（a）敲除后RBFOX2和PTBP1標(biāo)準(zhǔn)化剪接圖譜；（b）熱圖提示SBP敲除后所有HNRNP和SR蛋白圖譜中nSE-標(biāo)準(zhǔn)化eCLIP密度之間的差異,；（c）線條提示eCLIP峰圖上RBPs的平均數(shù)量,；（d）熱圖提示HepG2細(xì)胞中敲除RBFOX2外顯子上標(biāo)準(zhǔn)化的eCLIP信號(hào)；（e）線條提示在下游近內(nèi)含子區(qū)域RBFOX2和QKI標(biāo)準(zhǔn)化的eCLIP信號(hào)軌跡,。

13  RBP與染色質(zhì)相互作用

表觀標(biāo)記物通過剪接調(diào)節(jié)因子的共轉(zhuǎn)錄沉積影響RNA的加工過程,，并且調(diào)節(jié)型RNAs與染色質(zhì)相互作用，協(xié)調(diào)表觀和轉(zhuǎn)錄的狀態(tài),。為了探究特異的RBPs與DNA之間的關(guān)聯(lián),，研究者對(duì)HepG2細(xì)胞中58個(gè)核RBPs以及K562細(xì)胞中45個(gè)RBPs進(jìn)行了ChIP-seq實(shí)驗(yàn)。HepG2細(xì)胞中約52%的RBPs以及K562細(xì)胞中約64%的RBPs具有可重復(fù)的ChIP-seq峰圖,。這些RBPs具有廣泛的功能分類,，包括SR和hnRNP蛋白,，剪接體成分以及視為轉(zhuǎn)錄因子的RBPs,，例如POLR2G和GTF2F1?？紤]到已經(jīng)建立起的染色質(zhì)特征,，RBP的ChIP-seq峰圖在常染色質(zhì)上具有更多的重疊，特別是在單個(gè)RBPs差異的基因啟動(dòng)子區(qū)域。然而,，當(dāng)研究者將RBPs間ChIP-seq的峰圖進(jìn)行直接比較時(shí)研究者發(fā)現(xiàn)僅在一小部分特異的RBP對(duì)中有很少的重疊和很高的一致性（圖6b）,。總之,，這些RBPs占據(jù)大約30%超敏的或者開放的染色質(zhì)區(qū)域,，并且在兩種細(xì)胞類型中注釋的基因啟動(dòng)子區(qū)域占據(jù)70%，提示RBPs和人類基因組中轉(zhuǎn)錄活化的區(qū)域存在廣泛的相互聯(lián)系,。

接下來研究者探究了在什么程度ChIP-seq鑒定的DNA靶向與eCLIP中鑒定的RNA靶向在同一RBP上重合,，并且觀察到平均的重合中只有6%的eCLIP峰圖以及2.4%的ChIP-seq峰圖（圖6c）,。然而，在有限的RBPs中觀察到了更高的重合,，包括之前報(bào)道過的RBFOX2,。在非啟動(dòng)子區(qū)域，很少有RBPs在ChIP以及eCLIP信號(hào)中有重合,，表明ChIP信號(hào)反映了與DNA或者DNA結(jié)合蛋白之間的相互作用,，而在大部分RBP中不依賴于RNA的直接結(jié)合（圖6d）。然而,，研究者觀察到在HNRNPK和PCBP1/2之間存在關(guān)聯(lián),。這些RBPs具有共同的進(jìn)化歷史和結(jié)構(gòu)域組成，但是卻具有不同的功能,，在基因體內(nèi)ChIP-seq和eCLIP的峰圖之間重合（圖6d）,。PCBP1， PCBP2,，以及HNRNPK的ChIP-seq信號(hào)以eCLIP的峰圖為中心,，盡管HNRNPK的eCLIP峰圖上游具有一個(gè)輕微的上移,，這可能反映了這些潛在的RBP復(fù)合體在染色質(zhì)上依賴轉(zhuǎn)錄方向的方式的一種特異的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（圖6e）。因此盡管一些RBPs的ChIP-seq信號(hào)反映了在啟動(dòng)子區(qū)域前期或者共轉(zhuǎn)錄的關(guān)聯(lián),，一個(gè)子集也反映出在基因體內(nèi)DNA和RNA的靶向重合可能反映了不同的招募機(jī)制,。在有限數(shù)目的RBPs中ChIP-seq的靶向也反映出了RBP敲除后差異基因表達(dá)或者選擇性剪接的顯著富集，提示RBPs與染色質(zhì)的相互作用于RNA加工的下游相關(guān),。

14  亞細(xì)胞內(nèi)RBP的調(diào)節(jié)特征

每個(gè)RBP的亞細(xì)胞定位對(duì)于解釋其生物學(xué)功能是非常重要的,，又因?yàn)镽NA加工發(fā)生在多個(gè)時(shí)期和膜分離的位置。研究者系統(tǒng)的免疫熒光成像發(fā)現(xiàn)了不同的定位圖譜（圖7a）,，大部分RBPs與核以及胞漿中的多個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān),。考慮到在特異類型RNA加工過程中細(xì)胞器已知的功能,，定位在核內(nèi)的RBPs與45S前體rRNAs以及小核RNAs上eCLIP的富集對(duì)應(yīng),，定位在線粒體與線粒體RNAs的富集對(duì)應(yīng)，定位在核斑點(diǎn)與近端內(nèi)含子區(qū)域的富集對(duì)應(yīng),，證實(shí)了定位和RNA靶向之間存在關(guān)聯(lián)（圖7b）,。核仁的RBPs包括18個(gè)參與rRNA加工的因子，例如BOP1,， UTP18,，以及WDR3。重要的是,，其他15個(gè)RBPs在人類RNA加工功能中并沒有注釋,，表現(xiàn)出核仁定位（表1）。有三個(gè)RBPs在45S rRNA上的eCLIP信號(hào)富集：在大數(shù)據(jù)篩選出表現(xiàn)出rRNA加工缺陷的AATF以及PHF6,，以及酵母rRNA加工因子SAS10的人類同源物UTP3,。同樣在核內(nèi)，14/18個(gè)RBPs(78%)在一個(gè)或者多個(gè)小核RNAs上具有至少五倍的富集,，表現(xiàn)出核斑點(diǎn)的定位,，而只有51%的RBPs在HepG2細(xì)胞的eCLIP以及免疫熒光數(shù)據(jù)中顯示與斑點(diǎn)共定位。研究者同樣觀察到相對(duì)于胞漿中RBPs的剪接轉(zhuǎn)錄本,，核內(nèi)RBPs未剪接的轉(zhuǎn)錄本eCLIP的信號(hào)升高,，并且對(duì)RBP缺失相關(guān)剪接改變分析發(fā)現(xiàn)，定位在斑點(diǎn)的RBPs能夠影響更多的剪接事件,，這與核斑點(diǎn)在剪接機(jī)制中的組織和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵作用一致,。

聚焦于特異胞漿細(xì)胞器中的定位，42個(gè)RBPs定位在線粒體,，該細(xì)胞器具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄和RNA加工調(diào)節(jié),。這些線粒體定位的RBPs與在線粒體RNAs重鏈、輕鏈或者兩條鏈上顯著富集的eCLIP高度重合,，并且免疫熒光顯示的線粒體定位也與線粒體RNAs上eCLIP的顯著富集升高相關(guān)（圖7b-d）,。接下來研究者聚焦于DHX30,，它對(duì)于合適的線粒體核糖體組裝和氧化磷酸化非常重要,。與一些線粒體轉(zhuǎn)錄本相關(guān)聯(lián),，與之前RNA IP以及RIP-seq的數(shù)據(jù)一致，DHX30在所有注釋的基因下游中未注釋的H鏈區(qū)域富集且具有很大可能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖7d）,。由于線粒體H鏈轉(zhuǎn)錄的終止信號(hào)尚不明確,，研究者試圖推算這一位點(diǎn)標(biāo)記這一信號(hào)。這些案例說明RBPs細(xì)胞內(nèi)如何定位,，結(jié)合連接和功能缺失的數(shù)據(jù),，能夠幫助推斷不同細(xì)胞間隔和細(xì)胞器中轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。

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