RNA-蛋白之間的相互作用調(diào)節(jié)RNA生命的整個(gè)過程，從轉(zhuǎn)錄到成熟,、轉(zhuǎn)運(yùn),、定位以及降解。RNA和RBPs之間動(dòng)態(tài)的相互作用形成了功能型的核糖核蛋白（RNP）,，隨后實(shí)施廣泛的細(xì)胞功能,。掌握RNAs和RBPs之間內(nèi)在的聯(lián)系對(duì)于理解RNA調(diào)節(jié)細(xì)胞生理至關(guān)重要,。的確，RNA-蛋白之間相互作用的異常調(diào)節(jié)在一系列疾病中非常重要,，包括脊髓性肌肉萎縮癥,、肌萎縮性側(cè)束硬化癥以及一系列腫瘤，對(duì)于基于核酸的療法可作為前景的靶向,。不幸的是,，對(duì)這種相互作用從無差別的全系統(tǒng)景觀描述方法的缺乏限制了對(duì)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面的探究。研究者近期開發(fā)的OOPS方法能夠解決這個(gè)不足,，以無差別的方式全面的分析RNA結(jié)合蛋白組,。OOPS結(jié)合UV交聯(lián)來固定RNA-蛋白之間的相互作用，利用AGPC（又稱為TRIzol）提取富集RNA-蛋白加合物,。在正常的AGPC提取條件表,，未交聯(lián)的RNA分割到了最上層的水相，而未交聯(lián)的蛋白分割到了最底下的有機(jī)相,。交聯(lián)的RNA-蛋白加合物同時(shí)具有RNA和蛋白質(zhì)的物理化學(xué)特性,，因此停滯在中間層并且通過AGPC分離的重復(fù)操作富集。富集的蛋白結(jié)合RNAs（PBRs）或者RBPs通過酶消化恢復(fù)（圖1）,。

圖1 OOPS工作流程圖細(xì)胞被UV交聯(lián)（254nm）,，RNA、蛋白質(zhì)以及RNA-蛋白質(zhì)加合物依據(jù)它們的物化特性被分離,。RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)或者蛋白結(jié)合的RNA可能被重新消化加成物的相應(yīng)部分,，RNA以線條展示，蛋白以實(shí)心表示,。

OOPS直接應(yīng)用到任何能夠接受UV交聯(lián)的生物系統(tǒng),，獨(dú)立于RNA的聚腺苷酸狀態(tài)，因此適用于研究非編碼RNA-蛋白之間的相互作用以及原核生物的RBP組學(xué),。此外考慮到低產(chǎn)量的需求以及可靠性,，OOPS能夠結(jié)合多個(gè)蛋白組學(xué)定量的技術(shù)來闡釋在動(dòng)態(tài)條件下RBP的突變體。

1. 技術(shù)的發(fā)展

OOPS技術(shù)的發(fā)展在Queiroz等人的研究中有詳細(xì)的報(bào)道,。為了解釋OOPS在恢復(fù)RBPs時(shí)任何可能的差別,，研究者將UV交聯(lián)、AGPC分離后的中間層進(jìn)行了RNA測(cè)序,，并且發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)(>200核苷酸)的轉(zhuǎn)錄組是結(jié)合蛋白質(zhì)的,，提示在任意特定的RNA種系中都是無差別的。從蛋白質(zhì)的角度,，該方法的特異性可通過細(xì)胞培養(yǎng)過程中氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SILAC)對(duì)蛋白組學(xué)定量進(jìn)行檢測(cè)。研究者發(fā)現(xiàn)UV交聯(lián)能夠提高中間蛋白質(zhì)的豐度,，并且中間位置重復(fù)的AGPC分離更加富集了UV交聯(lián)的蛋白,。為了特異性的恢復(fù)中間與RNA相互作用的蛋白,，研究者利用RNases處理了中間層，在接下來的相分離中恢復(fù)的蛋白質(zhì)釋放到了有機(jī)相,。顯著的是,，中間層超過95%的蛋白是對(duì)RNase敏感的，這充分的說明RBP組的高度特異性富集,。

研究者利用OOPS捕獲胚胎的（HEK293）,、腫瘤衍生（U2OS）以及非腫瘤衍生（MCF10A）人類細(xì)胞系以及細(xì)菌(E. coli)，恢復(fù)了原核生物第一個(gè)RBPomes,，說明了OOPS的多效性,。研究者將OOPS應(yīng)用到動(dòng)態(tài)的框架，在微管解聚細(xì)胞停滯的條件下恢復(fù)了整體的蛋白質(zhì)組和RBP組學(xué),。此外,，通過比較整體的蛋白組學(xué)和RBP組學(xué)，研究者可以區(qū)分RNA結(jié)合活性的變化是RBP豐度的變化引起的,。

2. OOPS方法的應(yīng)用

OOPS從同一樣本中恢復(fù)游離的RNA和蛋白質(zhì)以及UV交聯(lián)的RNA-蛋白加合物,。這項(xiàng)技術(shù)最明顯的應(yīng)用是通過RNA測(cè)序和基于MS蛋白組學(xué)方法從全系統(tǒng)的景觀對(duì)這些相互作用進(jìn)行闡釋。然而,，交聯(lián)的蛋白質(zhì)-RNA加合物同樣可能作為更多特異性研究的原材料,。結(jié)合部分蛋白消化以及基于silica對(duì)肽段-RNA加合物的富集，交聯(lián)的肽段可被用于確定RNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域或者區(qū)域,。此外,，中間層部分可結(jié)合其他技術(shù)（如基于CLIP的技術(shù)），利用交聯(lián)的蛋白質(zhì)-RNA純化樣本簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)方法,。此外,，由于OOPS恢復(fù)的所有RNA是交聯(lián)蛋白知道，可結(jié)合基于oligo(dT)的mRNA結(jié)合蛋白恢復(fù)方法,，捕獲RNA相互作用組（RIC）以從非編碼的RNA結(jié)合蛋白中區(qū)分mRNA結(jié)合蛋白質(zhì),。

3. 與其他方法的比較

RBPs的高通量確定由基于RIC的方法確定，RIC已經(jīng)證實(shí)對(duì)不同真核生物系統(tǒng)中RBPs的分類是有用的,，但是對(duì)聚腺苷酸化的RNA結(jié)合蛋白是明顯有偏差的,，當(dāng)聚腺苷酸化RNA缺乏時(shí)妨礙了對(duì)RBPs的全面分類或者應(yīng)用。利用UV交聯(lián)和相分離來分離RBPs的選擇性方法有XRNAX和PTex,，盡管這三種方法有一些重要的差異,。OOPS需要的原始材料最少(對(duì)于人類細(xì)胞：OOPS ~3 × 106, PTex ~5 × 106，XRNAX ~8 ×107),。由于并未進(jìn)行直接的比較,，每種方法相對(duì)的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)不能確定。

4. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

OOPS的開發(fā)有兩個(gè)目的：為了對(duì)任意生物體內(nèi)RBPs進(jìn)行全面的分類以及研究RBP組的動(dòng)力學(xué)。目前已經(jīng)應(yīng)用到真核和原核細(xì)胞,，黏連的和非黏連的細(xì)胞培養(yǎng)以及有無細(xì)胞壁的細(xì)胞,。典型的OOPS實(shí)驗(yàn)包括UV放射形成蛋白-RNA加合物、細(xì)胞裂解,、相分離重復(fù)以富集加合物以及蛋白質(zhì)或者RNA的恢復(fù),。在不同的生物系統(tǒng)中所有的修飾都需要實(shí)施到實(shí)驗(yàn)方法，同樣重要的OOPS步驟在圖2中做了詳細(xì)的說明,。

圖2 OOPS工作流程圖示方法的步驟和完成時(shí)間結(jié)合OOPS中RNA和蛋白的圖解形式展示,，同時(shí)在右側(cè)對(duì)步驟有一個(gè)簡(jiǎn)要介紹。完成每一步的時(shí)間依據(jù)細(xì)胞的類型（步驟1-3）以及短時(shí)或者過夜消化的選擇（步驟69-90以及91-101）,。

5. 原始材料

通常,，在中間層包含更多物質(zhì)時(shí)OOPS更易操作。中間層的物質(zhì)依賴于原始材料的質(zhì)量,、RNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的效果以及細(xì)胞裂解的成分,，如需要在實(shí)驗(yàn)過程中優(yōu)化補(bǔ)充。過量體積的中間物對(duì)于分解,、純化以及消化是困難的,。當(dāng)在一種新的物種或者組織中進(jìn)行OOPS，UV劑量和原始材料需要優(yōu)化,。此外,，在含細(xì)胞壁的個(gè)體中，以RNA或者蛋白質(zhì)兼容的方式進(jìn)行細(xì)胞裂解需要優(yōu)化,。

6. 對(duì)照

OOPS的模塊化允許合并不同的對(duì)照提高確定的RBPs或者RNA結(jié)合中變化的可靠性,。當(dāng)在新的生物模型中對(duì)RBPs進(jìn)行分類時(shí)，優(yōu)先使用SILAC的對(duì)照,。將SILAC標(biāo)記UV交聯(lián)的細(xì)胞或者未交聯(lián)的細(xì)胞,、細(xì)胞裂解階段的混合樣本經(jīng)OOPS富集的蛋白質(zhì)豐度進(jìn)行比較，是對(duì)RBPs分類的經(jīng)典方法（圖3）,。對(duì)照組在一定程度上評(píng)估了利用OOPS進(jìn)行蛋白分離是依賴UV的,。OOPS在生物學(xué)重復(fù)組中保持一致的RNA量。因此,，可利用SILAC將RNase+/?處理后混合的OOPS中間層進(jìn)行RNA降解的選擇性對(duì)照（圖3）,。對(duì)照組在一定程度上評(píng)估了在最后干凈的中間層蛋白質(zhì)的出現(xiàn)是依賴于RNA的。對(duì)于合并穩(wěn)定同位素編碼氨基酸的生物學(xué)系統(tǒng)并不是一個(gè)合適的選擇,，一個(gè)單獨(dú)的最終的OOPS中間層可被分裂成RNAse +/?的樣本并且經(jīng)過無標(biāo)簽定量LFQ分析,，為OOPS富集蛋白質(zhì)的RNA結(jié)合狀態(tài)提供定量的證據(jù)，雖然沒有SILAC準(zhǔn)確,。同樣的,，分離的非交聯(lián)以及RNase陰性對(duì)照的樣本可通過免疫印跡檢測(cè),。

圖3 不同SILAC對(duì)照與OOPS流程圖示UV交聯(lián)以及RNase的SILAC對(duì)照可在步驟的對(duì)應(yīng)階段加入，紅色的箭頭代表結(jié)合樣本的步驟（步驟3是非交聯(lián)的對(duì)照,，步驟75是RNase陰性的對(duì)照）,。對(duì)于非交聯(lián)的對(duì)照，在細(xì)胞裂解液階段進(jìn)行混合（上部）,。對(duì)于RNase陰性對(duì)照，在最終相分離之前將清理的中間層混合（下部）,。

7. RNA結(jié)合蛋白的動(dòng)態(tài)學(xué)

OOPS更易適用于都通過定量比較不同條件下RBPs整合RBP的動(dòng)態(tài)學(xué),。例如基于TMT的分析被應(yīng)用于闡釋微管解聚細(xì)胞停滯條件下RBP的動(dòng)力學(xué)。TMT允許高度復(fù)用的能力,，降低了質(zhì)譜分析的時(shí)間以及每個(gè)樣本在獨(dú)立的液相以及串聯(lián)質(zhì)譜(LC?MS/MS)比較中錯(cuò)失的信息,。RBP組學(xué)的動(dòng)力學(xué)研究通過同時(shí)定量整體的蛋白和RNA結(jié)合蛋白的豐度來特異性的確定RNA結(jié)合發(fā)生改變的RBPs，與不同豐度下確定RBPs相對(duì)（圖4）,。從同一樣本中獲取整體的蛋白組學(xué)和RBP組學(xué)信息建議降低混雜因素和批次效應(yīng),。實(shí)驗(yàn)框架可補(bǔ)充以研究其他實(shí)驗(yàn)條件下RBP組學(xué)的動(dòng)態(tài)學(xué)。當(dāng)達(dá)到三個(gè)分析條件時(shí),，在不同條件下整體以及RNA結(jié)合蛋白的SILAC定量對(duì)于TMT定量是容易實(shí)施的,。

 圖4 TMT實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程在TMT實(shí)驗(yàn)中加入不同的處理（t），整個(gè)蛋白組學(xué)可從全部的裂解液中獲得,、TMT標(biāo)記以及與單一樣本結(jié)合,。不同的RBP組學(xué)可獨(dú)立獲得、標(biāo)記并且與第二個(gè)樣本結(jié)合,。

8. MS的技術(shù)考慮

OPPS技術(shù)是一項(xiàng)高度有效的RBP富集技術(shù),，數(shù)以百計(jì)蛋白的陰性對(duì)照不能檢測(cè)到信號(hào)。當(dāng)利用SILAC對(duì)UV交聯(lián)和未交聯(lián)的對(duì)照進(jìn)行RBPs相對(duì)豐度的定量,，一些肽段也僅在交聯(lián)樣本中觀察到,。研究者因此提示可調(diào)整MS背景以檢測(cè)SILAC對(duì)，以避免MS2錯(cuò)過這些在交聯(lián)樣本中高度富集的肽段,。

商業(yè)化可應(yīng)用的TMT試劑盒相較于RBP富集可標(biāo)記更多量的肽段,。在研究者的項(xiàng)目中，將一個(gè)0.80-mg TMT標(biāo)簽的小瓶等體積分成兩份標(biāo)記RBPs和整體的蛋白分離物(分別~10?25 μg和15?40 μg)取得了令人滿意的結(jié)果,。當(dāng)處理低反應(yīng)體積的RMT標(biāo)記,，維持TMT標(biāo)簽和肽段的正確濃度是非常重要的。同樣值得注意的是TMT的定量將低估倍數(shù)的變化,，利用Orbitrap質(zhì)譜儀與SPS-MS3可并且保留排除的肽譜與共分離的證據(jù)匹配而減弱,。

9. 局限性

在變性的條件下所有恢復(fù)RNA-蛋白相互作用的方法都需要先穩(wěn)定這些相互作用。目前UV交聯(lián)是一種“黃金標(biāo)準(zhǔn)”的方法以零距離共價(jià)穩(wěn)定RNA-蛋白之間的相互作用,。然而,，有報(bào)道稱在劑量高于1 J/cm2,，UV-C能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生單鏈的DNA-蛋白和蛋白-蛋白加合物，這些加合物并不限制在OOPS的中間層,，加合物中的一半更傾向于分離到有機(jī)層,。研究者建議根據(jù)選擇的生物系統(tǒng)評(píng)估需要UV的最適值（步驟2）。由于OOPS需要RNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用是穩(wěn)定的,，因此只適用于能夠接受UV交聯(lián)的生物系統(tǒng),。

OOPS可能用于通過同源大分子的酶連水解獲取RNA結(jié)合蛋白質(zhì)組以及蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組。然而結(jié)合的轉(zhuǎn)錄組或者蛋白組保留它們對(duì)應(yīng)的特性,，這將影響下游的分析,。例如，在蛋白酶消化后,，一個(gè)或多個(gè)氨基酸可能仍然與蛋白結(jié)合的轉(zhuǎn)錄組交聯(lián),。殘留的氨基酸干擾一些反轉(zhuǎn)錄酶，影響cDNA的合成和最終RNA的定量,，特別是考慮到全長(zhǎng)cDNA,。因此需要利用片段RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在交聯(lián)位點(diǎn)覆蓋的缺失仍然能被檢測(cè)到,。影響轉(zhuǎn)錄的定量,。如果研究者想從read覆蓋率的缺失推斷交聯(lián)位點(diǎn)，這可能提供了有用的信息,。從RBP組學(xué)的角度,，交聯(lián)的蛋白在基于大小的電泳中遷移不同，除非RNA被完全消化,。此外,，最常見的利用肽段光譜與算法匹配并不能控制過多的氨基酸和核苷酸，結(jié)果交聯(lián)的肽段不能被直接檢測(cè)到,。同時(shí)這一限制也能作為優(yōu)勢(shì),，因?yàn)樗试S使用定制開放的搜索引擎直接確定交聯(lián)的肽段以及蛋白的交聯(lián)位點(diǎn)。

最終研究者發(fā)現(xiàn)相分離方法能夠在中間層富集一組多糖蛋白不依賴于它們RNA結(jié)合的狀態(tài),。這些多糖蛋白可以利用RNase以及交聯(lián)的陰性對(duì)照樣本進(jìn)行確定,，但是在數(shù)據(jù)分析時(shí)需要將多糖肽段排除。

10. 預(yù)期結(jié)果

該方法適用于從同一樣本中恢復(fù)蛋白交聯(lián)的RNA（步驟46）以及非交聯(lián)的RNA（步驟7）,，以及RNA交聯(lián)蛋白（步驟90）和非交聯(lián)的蛋白（步驟9）,。

在蛋白酶K處理后，在瓊脂糖凝膠或者生物分析對(duì)交聯(lián)和未交聯(lián)RNA的RNA圖譜應(yīng)該相似（圖5a）,。然而由于殘留的氨基酸與RNA相連,，核糖體RNA的峰圖區(qū)域更寬。當(dāng)交聯(lián)時(shí)微小的峰圖可能在18S一下出現(xiàn),，并不影響轉(zhuǎn)錄的結(jié)果,。在未交聯(lián)樣本中中間層RNA的數(shù)量不代表交聯(lián)樣本中間層超過2-5%的RNA（圖5b）,。若超過5%的被檢測(cè)到，參照“故障檢測(cè)”（表1）,。

 圖5 OOPS RNA恢復(fù)（a）在蛋白酶K消化后,，非交聯(lián)（NC）和交聯(lián)的（CL）樣本水相和中間層典型的生物分析儀RNA圖譜；（b）左側(cè)代表1%瓊脂糖凝膠中的圖像發(fā)現(xiàn)主要的核糖體RNA條帶,，每個(gè)柱中UV的劑量（上部：水相,，游離的RNA；下部：中間層,，蛋白結(jié)合的RNA）,；右側(cè)利用Nanodrop (n = 3)測(cè)量不同UV劑量下RNA交聯(lián)的相對(duì)比例。

獲取RNP復(fù)合體最受限制的步驟之一是對(duì)交聯(lián)效率的優(yōu)化,。交聯(lián)效率可能被暴露在不同長(zhǎng)度UV下中間層RNA的比例影響。PBR%=中間層RNA的ng/（中間層RNA的ng數(shù)+第一個(gè)水相中游離的RNA）,。

從1 × 107人類貼壁細(xì)胞中獲取75%的交聯(lián)RNA并且超過10 ug的RBPs,，而非交聯(lián)的對(duì)照組恢復(fù)最少（圖6）。人類細(xì)胞系中每個(gè)OOPS實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)到~1,500個(gè)結(jié)合蛋白,，超過10 ug的RBPs,。當(dāng)利用SILAC進(jìn)行LC?MS/MS分析，研究者不建議檢測(cè)SILAC對(duì)作為MS2片段的前提,。依據(jù)這條建議,，期盼有三個(gè)群體的蛋白：與RNase或者交聯(lián)陰性對(duì)照比沒有富集的蛋白、與陰性對(duì)照比富集的蛋白(RBPs)以及陰性對(duì)照中沒有檢測(cè)到信號(hào)的蛋白（高度富集的RBPs）,。OOPS是一種高度有效富集RBP的技術(shù),，在陰性對(duì)照樣本中通常檢測(cè)不到信號(hào)。如果與重復(fù)組一致,，這些蛋白被視為一個(gè)RBP,。圖7a展現(xiàn)了交聯(lián)+/?和RNase +/?實(shí)驗(yàn)中SILAC的比率。

圖6 銀染說明OOPS的不同階段（a）OOPS方法應(yīng)用于非交聯(lián)（CL-）和交聯(lián)的（CL+）U2OS細(xì)胞中,，從以下階段獲得蛋白樣品：分離之前的細(xì)胞裂解（inputs）,、每個(gè)經(jīng)過三輪TRIzol分離后的有機(jī)相（有機(jī)相1,2,3）以及RNase和最終TRIzol分離后的有機(jī)相（有機(jī)相4）。樣本隨著蛋白梯度marker在4-12%的Bis-Tris膠上進(jìn)行,，隨后進(jìn)行銀染,；（b）陽性的RBP對(duì)照的免疫印跡(NCL; Nucleolin, 100KDa, PTB; 60KDa；HuR; 36KDa)以及陰性對(duì)照蛋白(H3; Histone-H3; 18KDa,、β-tubulin; 55 KDa),。

在OOPS中對(duì)整體蛋白豐度和RNA結(jié)合蛋白豐度平行定量來對(duì)不同條件下RBP組學(xué)的動(dòng)態(tài)變化定量時(shí)，可以利用線性模型確定RNA結(jié)合中發(fā)生重要變化的蛋白,。對(duì)于大多數(shù)生物刺激,，感興趣的蛋白將會(huì)是那些在整體蛋白豐度上有很小或者沒有變化的蛋白,，并且在RNA結(jié)合豐度具有可重復(fù)性的改變。圖7b展示了之前報(bào)道數(shù)據(jù)中糖酵解途徑蛋白的整體的和RNA結(jié)合的豐度,。

 圖7 OOPS MS結(jié)果（a）利用U2OS進(jìn)行SILAC交聯(lián)(CL) +/? 以及RNase +/?實(shí)驗(yàn)的預(yù)期結(jié)果,。在陰性對(duì)照樣本中并未檢測(cè)到蛋白信號(hào)，與CL或者RNase樣本中的偽值等價(jià),。這些偽值代表在CL或者RNase條件下高度富集的蛋白,。Log的比率接近0代表蛋白沒有顯著富集，可能是非RNA結(jié)合,；（b）諾可達(dá)唑停滯0 h以及釋放6 h和23 h全部和RNA結(jié)合蛋白的豐度,。蛋白的豐度是每個(gè)樣本的中位值并且與給定樣本中整體蛋白質(zhì)豐度相對(duì)，并且在整體的和RNA結(jié)合的定量中可比較,。結(jié)果顯示了糖酵解信號(hào)通路的成員,。在停滯和釋放的時(shí)間點(diǎn)觀察到RNA結(jié)合蛋白的顯著升高。

正交有機(jī)相分離的方法（OOPS）是一種快速,、有效并且可重復(fù)的方法能夠以無差別的方式將交聯(lián)的RNA-蛋白加合物進(jìn)行純化,。OOPS避免了分子標(biāo)簽或者捕獲聚腺苷酸RNA。相反,，它是在標(biāo)準(zhǔn)的TRIzol分離到RNA-結(jié)合蛋白（RBPs）富集之間取樣并且它們同源結(jié)合RNA,。OOPS的特異性是通過RNases消化的富集界面或者蛋白酶釋放的RBPs或者蛋白結(jié)合RNA分別實(shí)現(xiàn)的。在本文中研究者呈現(xiàn)了從同一樣本中純化蛋白-RNA加合物,、游離蛋白質(zhì)以及游離RNA一步步的方法,，并且進(jìn)一步描述了OOPS如何應(yīng)用到人類細(xì)胞、擬南芥,、裂殖酵母,、大腸肝菌中，以及它如何用來研究RBP的動(dòng)力學(xué),。