作者：小又

環(huán)狀RNA自2013年發(fā)現(xiàn)以來(lái),，已成為非編碼RNA研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。環(huán)狀RNA與疾病的關(guān)系密切,，在多種實(shí)體瘤和血液腫瘤中均有環(huán)狀RNA的研究,。然而需要承認(rèn)的是，對(duì)環(huán)狀RNA,，我們的研究還處于初步階段,，主要是由于測(cè)序方法和技術(shù)的限制，很多環(huán)狀RNA還尚待鑒定,。

那么如果想開(kāi)展環(huán)狀RNA的研究,，如何選擇最佳的方法鑒定到某一體系中最全的環(huán)狀RNA呢？該用什么方法獲得更高純度的環(huán)狀RNA,？如何使環(huán)狀RNA的測(cè)序信號(hào)不被豐度更高的線性RNA掩蓋,？

你要的答案,，都在這里啦！

近日,，美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究所（NIH）的KotbAbdelmohsenand和Myriam Gorospe在國(guó)際期刊Nucleic Acids Research上發(fā)表研究成果《High-purity circular RNA isolation method (RPAD) reveals vast collection of introniccircRNAs》,。

他們建立了高純度提取環(huán)狀RNA的新方法——RPAD，采用該方法分析發(fā)現(xiàn)許多由外顯子組成的環(huán)狀RNA,，即使擁有一樣的接合位點(diǎn)（junction site）,，他們的大小和序列卻是不同的，并且,，與以往研究不同的是,，大量?jī)?nèi)含子序列形成的環(huán)狀RNA被鑒定，改變了傳統(tǒng)的認(rèn)為環(huán)狀RNA大多來(lái)源于外顯子的觀點(diǎn),。

下面,，我們來(lái)詳細(xì)解讀該方法。

研究者建立的新方法——RPAD,，全稱是“RNase R treatment followed by Polyadenylation and poly (A) + RNADepletion (RPAD)”，實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)下圖,。由于環(huán)狀RNA沒(méi)有末端,，所以可以抵抗核酸外切酶RNase R的剪切作用，而大部分線性的RNA,，包括mRNA,，rRNA以及miRNA都會(huì)被RNase R剪切而降解。

遺憾的是,，RNase R并不能完全將線性的RNA去除,，這就給進(jìn)一步分析環(huán)狀RNA帶來(lái)了干擾，于是研究者給剩下的線性RNA加上poly(A)的尾巴,，利用偶聯(lián)了Oligo(dT)的柱子純化不含poly(A)尾的環(huán)狀RNA,。

該方法可以大大提高環(huán)狀RNA的純度，減少線性RNA的污染（下圖）,。只經(jīng)RNase R處理,，線性RNA（黑色柱子）含量仍較高，而經(jīng)RPAD處理后,，線性RNA（橘色柱子）殘留較低,。

利用該方法，研究者鑒定了一批新的RNA,，并發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA也存在可變剪接的現(xiàn)象,，即結(jié)合位點(diǎn)序列一致，但環(huán)狀RNA的大小和序列不完全相同（下圖）,。

總的來(lái)說(shuō),，該研究建立的新方法以及鑒定到的新的環(huán)狀RNA均有重要意義,，也為更全面的研究環(huán)狀RNA的產(chǎn)生和功能奠定了基礎(chǔ)。想開(kāi)展環(huán)狀RNA研究的學(xué)者們不妨嘗試RPAD的處理方法,，可以獲得更多的環(huán)狀RNA信息,。

值得注意的是，現(xiàn)在研究的環(huán)狀RNA大多來(lái)源于外顯子,，而通過(guò)PRAD的方法,，可以鑒定到很多來(lái)源于內(nèi)含子的環(huán)狀RNA，而這類來(lái)源于內(nèi)含子的環(huán)狀RNA的功能還是未知的,，值得探索,。

參考文獻(xiàn)：Panda AC, De S, Grammatikakis I, Munk R, Yang X, Piao Y, Dudekula DB, Abdelmohsen K, Gorospe M. (2017) High-purity circular RNA isolation method (RPAD) reveals vast collection of introniccircRNAs. Nucleic Acids Res [Epub ahead of print]