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基因定點(diǎn)突變：為了研究某一基因的功能，我們通常不僅需要研究其野生型基因的功能,，也需要進(jìn)一步去挖掘它發(fā)揮作用時(shí)是哪一個(gè)結(jié)構(gòu)域,，甚至是哪一個(gè)氨基酸發(fā)揮了作用。而這里面就涉及到了如何設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物的問(wèn)題,，今天為大家介紹一個(gè)在線網(wǎng)址--quickchange primer design,，可以非常方便快捷為我們?cè)O(shè)計(jì)出合適的引物。你可以直接百度搜索quickchange或者輸入https://www./store/primerDesignProgram.jsp就可以進(jìn)入到該網(wǎng)站的主頁(yè)面,。 
該網(wǎng)站可以設(shè)計(jì)單點(diǎn)和多點(diǎn)突變引物以及刪除或者插入一段DNA序列（ 插入時(shí)只能插入小的DNA片段）,。我們今天著重講解如何利用該網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物，并利用該引物構(gòu)建出我們想要的突變體,。
如果我們實(shí)驗(yàn)室又窮，又不想買突變?cè)噭┖性趺崔k,？我們可以不用管第2步,，默認(rèn)其設(shè)置，不用試劑盒也可以構(gòu)建出我們想要的突變體,。第3個(gè)選項(xiàng)輸入我們的DNA序列,，既可以通過(guò)Browse選項(xiàng)上傳已經(jīng)下載好的序列，也可以直接粘貼文本格式或FASTA格式的DNA序列,。第4步將DNA序列轉(zhuǎn)換成蛋白序列（Upload Translated）,。下面我們以人的TP53基因?yàn)槔M(jìn)行演示：首先我們從NCBI上下載TP53基因序列,，將其粘貼到相應(yīng)選項(xiàng)框內(nèi)，并轉(zhuǎn)換為氨基酸序列,，如下圖：
同時(shí)我們也會(huì)看到多出來(lái)的選項(xiàng)5,，如果我們要進(jìn)行點(diǎn)突變，則需要勾選5后面的灰色圓圈
在下面這個(gè)框選中我們要突變的目的氨基酸,，如紅色圓圈標(biāo)出所示：
同時(shí)在下面選框勾選出我們想要突變成的氨基酸,，這個(gè)就表示我們將N29突變?yōu)?/span>I（N29I），S33突變?yōu)?/span>K (S33K),，L35突變?yōu)?/span>E (L35E),，E55突變?yōu)?/span>C (E55C)
該網(wǎng)站可以同時(shí)設(shè)計(jì)針對(duì)7個(gè)氨基酸的突變引物,接下來(lái)點(diǎn)擊Primer Design即可得到引物序列：
同時(shí)也能看到對(duì)應(yīng)引物的長(zhǎng)度及其相應(yīng)的Tm值：
接下來(lái)我們?cè)僦v如何刪掉一段DNA序列，同樣我們選擇or下面的小圓框,，選中兩個(gè)氨基酸,，即可設(shè)計(jì)出刪掉這兩個(gè)氨基酸之間片段的引物（注意：這兩個(gè)氨基酸不會(huì)被刪除）。
比如我們想刪掉第29個(gè)氨基酸和第51個(gè)氨基酸之間的片段,，我們可選中29N和51E即可,，如下圖
依舊點(diǎn)擊Primer Design即可設(shè)計(jì)出引物，且能看到引物與模板之間的配對(duì)情況,。
好了,，是不是感覺(jué)定點(diǎn)突變的引物設(shè)計(jì)很簡(jiǎn)單呢？接下來(lái),，我們拿到引物就可以進(jìn)行突變體構(gòu)建了,。Nuclease-free water：up to 50 μL2. 然后就按照你所買的DNA高保真酶（PCR Enzyme）的說(shuō)明書(shū)設(shè)置PCR反應(yīng)條件，我一般設(shè)置30個(gè)循環(huán),。3. PCR反應(yīng)結(jié)束后,，直接加入Dpn I 限制性內(nèi)切酶（待突變的質(zhì)粒在細(xì)菌中會(huì)被甲基化修飾，因此,，用Dpn I可以消化掉相應(yīng)的模板質(zhì)粒,，而使突變質(zhì)粒保留下來(lái)）及相應(yīng)的buffer，37℃酶切反應(yīng)1h左右(也可相應(yīng)的縮短或延長(zhǎng)酶切反應(yīng)時(shí)間),。4.直接用DNA回收試劑盒進(jìn)行膠回收,，根據(jù)濃度，取100ng進(jìn)行轉(zhuǎn)化,，涂平板,。6.隨后將測(cè)序正確的樣品提質(zhì)粒,，即可進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn),。有沒(méi)有覺(jué)得點(diǎn)突變很簡(jiǎn)單呢？如果你正在進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn),，不妨試一試,。注：個(gè)人經(jīng)驗(yàn),，一般單點(diǎn)突變成功率較高，可達(dá)100%,。在進(jìn)行多點(diǎn)突變時(shí)可將多對(duì)引物放在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行,，但相應(yīng)的效率也會(huì)降低。筆者做過(guò)同時(shí)突變兩個(gè)點(diǎn)和四個(gè)點(diǎn),，將突變引物全部加到一個(gè)體系中,，陽(yáng)性率在25%~60%之間不等。
關(guān)注后獲取《科研修煉手冊(cè)》1,、2,、3、4,、5,、6、7,、8,、9
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