如何順利完成你的PCR實驗？

stingray928 2019-01-30

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聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction,，PCR）是一種體外核酸擴增系統(tǒng),，其原理類似DNA分子的天然復(fù)制過程，是將在待擴增的DNA片段和與其兩側(cè)互補的兩個寡聚核苷酸引物,，經(jīng)變性,、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增 2n 倍,。該技術(shù)已成為分子生物學中一種有助于DNA克隆及基因分析的必需工具,。

PCR實用技巧—增加PCR特異性

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1.primers design

這是最重要的一步。理想的,，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：

1)足夠長,，18～24bp,，以保證特異性，當然,，不是說越長越好,，太長的primer同樣會降低特異性，并且降低產(chǎn)量,；

2)GC%,，40%~60%；

3)5'端和中間序列要多G/C,，以增加穩(wěn)定性,；

4)避免3'端GCrich，最后5個堿基不要多于2個G/C,；

5)避免3'端的互補,，否則，容易造成DIMER,；

6)避免3'端的錯配,；

7)避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)；

8)附加序列(RTsite,，Promoter sequence)加到5'端,，在算Tm值時不算，但在檢測互補和二級結(jié)構(gòu)時要加上它們,；

9)使用兼并primer時,，要參考密碼子使用表，注意生物偏好性,，不要在3'端使用兼并primer,，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；

10)最好學會使用一種design software,，PP5,，Oligo6，DNA star,，Vector NTI,，Onlinedesign et al.

PCR擴增重要標準—靈敏度

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靈敏度指的是PCR擴增反應(yīng)能夠檢測到目的基因最小值。研究結(jié)果表明,，影響PCR擴增效率的因素,，如,，模板的復(fù)雜程度與完整性,、引物純度及其與模板結(jié)合效率、反應(yīng)溫度,、DNA的熱穩(wěn)定性與擴增性能,、反應(yīng)緩沖液的離子組成（主要指：陽離子）,、反應(yīng)優(yōu)化劑等，均決定PCR實驗檢測靈敏度,。在最佳擴增條件下,，常規(guī)PCR反應(yīng)能夠檢測到pg(10^-12g)數(shù)量級目的基因。對于一個特定的目的基因,，模板與引物通常都是已經(jīng)限定好的因素,。因此，選擇什么樣的PCR反應(yīng)體系（包括：DNA聚合酶與反應(yīng)緩沖液等）就是研究者提高PCR實驗靈敏度的關(guān)鍵因素了,。

與實驗室自配PCR擴增體系相比,，東盛PCR Mix對反應(yīng)緩沖液中的成分進行了優(yōu)化，并加入了適當比例的反應(yīng)增強劑（PCREnhancer）,，提高了DNA聚合酶熱穩(wěn)定性,，顯著降低模板二級結(jié)構(gòu)對PCR擴增性能的影響，使得DNA聚合酶處于最適活性狀態(tài),，從而獲得比自配體系更高的檢測靈敏度,。即使反應(yīng)體系中只有幾個目的基因拷貝，也能輕松檢測,。

PCR擴增重要標準—特異性