與其他蛋白一樣，單克隆抗體具有許多翻譯后修飾,，如末端的改變,、糖基化、脫酰氨基作用,、異構(gòu)化,、氧化、分裂,、聚合等,。幾乎所有的這些修飾都會引起單抗表面電荷的改變,，直接的(改變電荷集團數(shù)目)或間接的(引起構(gòu)象改變)，這就是單抗的電荷異質(zhì)性,。

基于單抗所帶電荷可對其進行分離,，進而可對電荷異質(zhì)體進行分析，常用的分析方法有等電聚焦凝膠電泳(IEF),、毛細管等電聚焦凝膠電泳(cIEF),、陽離子交換色譜法(CEX)和陰離子交換色譜法(AEX)。與主峰相比,，這些變異體通常被稱為酸性變異體和堿性變異體,，即酸峰和堿峰。采用CEX分析時,，酸峰早于主峰洗脫出來,，而堿峰晚于主峰洗脫出來，如圖1所示,。

圖1 酸峰,、主峰和堿峰的CEX圖譜

(圖片來源于參考文獻3)

酸峰和堿峰的來源可分為以下幾個方面：N位糖基化、C末端賴氨酸不均一性,、氨基酸氧化,、天冬酰胺脫酰胺化及天冬氨酸異構(gòu)化、共價加合物和N末端谷氨酰胺及谷氨酸環(huán)化等,。

不同水平的唾液酸化被認為是電荷異質(zhì)體的來源之一，當用CEX和IEF方法進行測定時表現(xiàn)為酸性峰,。此外,，當糖基化的整個糖鏈被PNGase F移除時通常會導致兩種結(jié)果：第一，由于天冬氨酸的暴露而呈現(xiàn)酸峰,；第二,，因唾液酸被一起移除而呈現(xiàn)堿峰。其次,，F(xiàn)c端的構(gòu)象會受其糖基化修飾的影響,，進而影響到抗體所帶的表面電荷。還有報道稱,，高甘露糖型在CEX檢測中表現(xiàn)為酸峰,。

高水平的唾液酸化會影響單抗與FcγRIIIa的結(jié)合，進而導致ADCC活性的降低,。

抗體在生產(chǎn)或儲存過程中會與接觸的化學物質(zhì)等發(fā)生作用，形成不同類型的共價加合物,。主要有三種方式：①抗體上的電荷集團因相互作用而丟失,；②小分子與抗體發(fā)生作用,，聚集在抗體上產(chǎn)生電荷；③由于反應時抗體結(jié)構(gòu)改變產(chǎn)生的電荷,。

常見的共價加合物主要有：

a. 無酶介入的糖苷化,，當糖(半乳糖等)富裕時無論是在生產(chǎn)、儲存,、甚至在人血漿中均會發(fā)生,，且一般會發(fā)生于賴氨酸殘基上。Andya等研究中發(fā)現(xiàn),，當噴霧干燥的樣品在30℃儲存9個月后,，用IEF檢測可觀察到酸峰的改變，推測這種改變是由過量的半乳糖造成的,；

b. 有學者在轉(zhuǎn)基因山羊合成的單抗中發(fā)現(xiàn)了馬來酸修飾,，這種修飾發(fā)生于N端的輕鏈或者重鏈中，且在CEX中發(fā)現(xiàn)為酸峰,；

c. 當單抗被儲存在含有硫代硫酸鈉的緩沖液中時,，單抗與硫代硫酸鹽形成加合物，表現(xiàn)為酸峰,；

d. 還有研究發(fā)現(xiàn),，當單抗在檸檬酸和琥珀酸的緩沖液中孵化時會導致酸峰的增加，質(zhì)譜顯示這是由于單抗與檸檬酸和琥珀酸發(fā)生反應造成的,。

蛋白的氧化是比較常見的，且通常會影響到蛋氨酸,、半胱氨酸,、組氨酸和色氨酸等。對于IgG1單抗,，報道最多的是蛋氨酸殘基氧化成蛋氨酸亞砜,，其發(fā)生于CH2區(qū)域的M252位及CH3區(qū)域的M428位的蛋氨酸殘基，表現(xiàn)為堿峰,，且叔丁基化過氧氫(tBHP),、H2O2,、紫外均可成為蛋氨酸氧化的誘因,。此外，重鏈上CDR3區(qū)域的色氨酸殘基的氧化也有報道,。

從單抗的三級結(jié)構(gòu)來講,，M252和M428位于CH2和CH3的交接處，靠近FcRn結(jié)合位點,，但還沒有研究表明這兩個殘基對于FcRn結(jié)合具有關(guān)鍵作用,，且M252和M428的氧化對FcRn結(jié)合的影響也還沒有確定,。

IgG類單抗C末端的重鏈上均存在賴氨酸殘基修飾,，正常情況下可以被羧肽酶切除,。然而，這種切除是不完全的,，通常會導致一條重鏈或兩條重鏈上還有賴氨酸殘基修飾,。而當細胞內(nèi)的羧肽酶水平較高時，兩條重鏈上則沒有賴氨酸殘基修飾,。這便是C末端賴氨酸不均一性,，也稱為k0、k1,、k2,。

C末端賴氨酸不均一性可以采用CEX和IEF的方法進行測定，由于賴氨酸胺的存在表現(xiàn)為堿峰,。如果需要將賴氨酸移除,，選擇羧肽酶B (CPB)會是一個快速的方法。值得一提的是,，C末端賴氨酸不均一性不會影響單抗的效能及安全性,，但是C末端賴氨酸不均一性依然是評價單抗的參考。

N末端谷氨酰胺(Q)及谷氨酸(E)環(huán)化形成焦谷氨酸鹽(pE)也會造成單抗電荷異質(zhì)性,，其作用機制如圖2所示。一般認為,，環(huán)化酶會介入到pE的形成中,，但純化后的單抗在儲存過程中也有發(fā)現(xiàn)環(huán)化的發(fā)生，即Q及E環(huán)化不論環(huán)化酶存在與否均會發(fā)生,，這是一種自發(fā)過程,。

在CEX檢測中Q環(huán)化表現(xiàn)為酸峰，而E環(huán)化則是中性的,，這是因為在谷氨酸環(huán)化時各產(chǎn)生一個酸性和堿性集團,。與C末端賴氨酸不均一性類似，N末端谷氨酰胺及谷氨酸環(huán)化對單抗的效能及安全性沒有影響,。

圖2 N末端谷氨酰胺(Q)及谷氨酸(E)環(huán)化形成焦谷氨酸鹽(pE)

(圖片來源于參考文獻1)

除去上面提到的可自發(fā)發(fā)生的反應外，溫和條件下自發(fā)進行的天冬酰胺(N)脫酰胺化和天冬氨酸(D)異構(gòu)化也是單抗電荷異質(zhì)體的重要組成,。如圖3所示,，這兩種反應都會形成一種共同的中間產(chǎn)物——琥珀酰亞胺，之后再水解成3:1的異構(gòu)天冬氨酸(isoD)和天冬氨酸(D)。天冬氨酸異構(gòu)化不會改變單抗的電荷,，但會影響單抗的結(jié)構(gòu),，而天冬酰胺脫酰胺化通常被報道為酸峰。

圖3 天冬酰胺脫酰胺化和天冬氨酸異構(gòu)化機制

(圖片來源于參考文獻1)

天冬酰胺脫酰胺化及天冬氨酸異構(gòu)化的速率取決于眾多原因,，主要有氨基酸序列,、高階結(jié)構(gòu)和pH。C末端天冬酰胺脫酰胺化和天冬氨酸異構(gòu)化與其連接的氨基酸有關(guān),，當與甘氨酸連接時速率最大,，其次為組氨酸和絲氨酸。單抗天冬酰胺脫酰胺化及天冬氨酸異構(gòu)化是始終存在的,，事實上其比由單抗本身半衰期造成的影響還要大,，合適的發(fā)酵條件和儲存溫度是降低天冬酰胺脫酰胺化及天冬氨酸異構(gòu)化的主要方式。

天冬酰胺脫酰胺化會導致1 Da的質(zhì)量增加,，酶降解后可采用質(zhì)譜進行測定,，但酶降解過程可能會引進新的片段，降解方法需經(jīng)過優(yōu)化后才能保證得到良好的結(jié)果,。而天冬氨酸異構(gòu)化的測定則更具挑戰(zhàn),，異構(gòu)化不會產(chǎn)生質(zhì)量變化。但如果在琥珀酰亞胺水解時,，加入重氧分子(¹⁸O)則可以檢測到,。此外，含有N,、D和isoD的多肽采用反相色譜也可進行檢測,，其洗脫順序為isoD-N-D。

單抗天冬酰胺脫酰胺化的位點主要有兩處：CDRs和Fc端的肽段GFYPSDIAVEWESN384GQPEN389NYK,，而天冬氨酸異構(gòu)化的位點還沒有明確,，但在CDRs已發(fā)現(xiàn)有天冬氨酸的異構(gòu)化，如表1所示,。在眾多學者的研究中,，CDRs區(qū)域及N387、N389位的天冬酰胺脫酰胺化對單抗而言形成了酸性峰,，但是中間產(chǎn)物琥珀酰亞胺的不完全水解(堿性環(huán)境下利于水解)會導致堿峰的產(chǎn)生,。

由于易脫酰胺化的兩類天冬酰胺均位于CH3區(qū)域，而FcRn的結(jié)合位點位于CH2和CH3的交接處,，F(xiàn)cγR的結(jié)合位點位于CH2附近的鉸鏈區(qū),，因此天冬酰胺脫酰胺化可能不會影響到單抗的ADCC功能及半衰期，但這點還有待確認,。

表1 天冬酰胺脫酰胺化和天冬氨酸異構(gòu)化位點

(圖片來源于參考文獻1)

造成單抗電荷異質(zhì)性的原因是錯綜復雜的,，除去上面提到的因素外,，單抗聚體及片段,、二硫鍵及三硫鍵,、絲氨酸突變?yōu)榫彼岬榷紩绊懙絾慰闺姾僧愘|(zhì)性。電荷異質(zhì)性的改變,，有些會影響單抗效力,，有些則不會，但是保證電荷異質(zhì)性的一致性對單抗的生產(chǎn)同樣重要,。

參考文獻：

1. Heterogeneityof Monoclonal Antibodies Revealed by Charge-Sensitive Methods,；

2. Chromatographicanalysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies；

3. Chargevariants in IgG1 Isolation, characterization, in vitro binding properties andpharmacokinetics in rats,。