在眾多的蛋白質(zhì)翻譯后修飾中，糖基化修飾是最重要和最復(fù)雜的修飾之一,，也是評(píng)價(jià)抗體的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一,。單抗藥物功能的實(shí)現(xiàn)與其糖基化修飾密切相關(guān),，糖基化修飾會(huì)影響蛋白的性能，如構(gòu)象,、穩(wěn)定性,、溶解度、藥物代謝動(dòng)力學(xué),、活性及免疫原性,。本文中，筆者就糖基化及其對(duì)抗體藥物的穩(wěn)定性/半衰期,、安全性及生物活性進(jìn)行了簡要概述,。

糖基化是蛋白質(zhì)重要的翻譯后修飾之一，根據(jù)糖基化的修飾位點(diǎn)可將糖基化分為N位糖基化和O位糖基化,。N位糖基化位于Asn-297,，寡糖中的N-乙酰氨基葡萄糖與天冬酰胺殘基上的酰胺氮連接修飾蛋白，起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完成于高爾基體,；O位糖基化由寡糖中的N-乙酰半乳糖與絲氨酸或蘇氨酸殘基上的羥基連接修飾蛋白,，在高爾基體完成。

動(dòng)物細(xì)胞分泌的免疫球蛋白中N位的糖基化是最普遍的糖基化修飾,，同時(shí)也是研究最多的一種糖基化修飾,。以IgG1為例，其重要的糖基化修飾位點(diǎn)位于Fc端,，且根據(jù)其末端精細(xì)結(jié)構(gòu)(長度,、分支及單糖排列)的不同又可分為復(fù)合型、雜合型和高甘露糖型,，如圖1所示,。

圖1 單抗中N位糖基化的位置(左)及其三種主要類型(右)

(圖表來源于參考文獻(xiàn)1)

在圖1中可以看到IgG1的糖基化修飾為復(fù)合型，其糖基化以巖藻糖(Fuc)為核心,，再由N-乙酰氨基葡萄糖(N-GlcNAc)分出兩條等長的分支,，其分支上伴以甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)和唾液酸(Sia),，由此構(gòu)成IgG1的Fc端N位糖基化,。根據(jù)兩條分支中的單糖不同，可將IgG1的糖基化修飾類型分為表1中的不同糖型,，正是由其糖型的不同導(dǎo)致單抗的免疫原性,、生物活性、藥物動(dòng)力學(xué)等的不同,。

表1 IgG1的Fc端糖基化修飾類型

注：N-Acetylneuraminicacid,，N-乙酰神經(jīng)氨酸即為唾液酸；

表格來源于參考文獻(xiàn)3,。

不同的糖基化修飾對(duì)抗體的穩(wěn)定性和半衰期,、安全性及生物活性具有不同的影響,，下面進(jìn)行一一敘述。

蛋白糖基化修飾最明顯的作用就是其可以增加蛋白的穩(wěn)定性及溶解度,。有研究表明,，糖基化可以通過隱藏蛋白與蛋白酶的結(jié)合位點(diǎn)而保護(hù)蛋白。Rudd等發(fā)現(xiàn),，N-糖基化對(duì)鄰近多肽的位阻保護(hù)是由于糖基化與親水性氨基酸形成了氫鍵,。糖基化修飾還可以阻礙蛋白酶與抗體的結(jié)合，從而增加抗體的穩(wěn)定性,。

糖基化中的唾液酸糖型可以延長血清中的糖蛋白的存在時(shí)間,。當(dāng)糖蛋白的糖鏈在半乳糖修飾終止時(shí)或去唾液酸化后，則其便可以被唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)識(shí)別,，從而導(dǎo)致半衰期的大幅減少,。位于肝細(xì)胞表面的ASGPR不能識(shí)別全唾液酸化的糖蛋白，但當(dāng)其隨著血液循環(huán)時(shí)會(huì)被血液中的非特定唾液酸酶去唾液酸化,，祼露的半乳糖糖基可以被ASGPR識(shí)別,，糖蛋白被降解。還有研究稱高甘露糖型會(huì)降低血清中抗體的半衰期,。

Junttila等的研究發(fā)現(xiàn)巖藻糖化對(duì)IgG1的半衰期具有影響,，與正常的曲妥珠單抗相比，巖藻糖化的曲妥珠單抗的藥物代謝動(dòng)力學(xué)發(fā)生了改變,，從而導(dǎo)致其半衰期適度降低,。

一般情況下，藥物在人體內(nèi)穩(wěn)定性越高,、半衰期越長,，則會(huì)發(fā)揮更大的效力。就抗腫瘤藥物,，如果藥物穩(wěn)定性較高,、半衰期較長，臨床治療時(shí)的給藥量可以適當(dāng)降低,、給藥間隔也可設(shè)計(jì)的更長,，而達(dá)到的效果一樣。但隨著藥物在人體內(nèi)的穩(wěn)定性及半衰期增加,，由于潛在的脫靶可能,，藥物的安全性也將成為需要考慮的因素之一。

抗體的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQAs)是評(píng)判其是否合格的標(biāo)準(zhǔn),，CQAs必須是在一個(gè)合適的范圍內(nèi)，以保證藥物的有效性,，更重要的是藥物的安全性,。通過影響Fc端的效應(yīng)功能,，F(xiàn)c端的糖基化修飾會(huì)對(duì)抗體的安全性造成影響，其表現(xiàn)形式為免疫原性,、PK/PD(藥物代謝動(dòng)力學(xué)/藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué))等,。

抗體的發(fā)展先后經(jīng)歷了鼠原性抗體、嵌合性抗體,、人源化抗體,，再到最后的全人源抗體，抗體的免疫原性一直在不斷的降低,。對(duì)于糖基化修飾,，人體細(xì)胞專一性的合成Neu5Ac唾液酸，而其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞不僅合成Neu5Ac唾液酸,，還可合成對(duì)人類具有免疫原性的Neu5Gc唾液酸,。抗體生產(chǎn)時(shí)常用CHO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞,，而CHO細(xì)胞通常會(huì)高表達(dá)唾液酸,，并且其中能引起人體免疫反應(yīng)的Neu5Gc唾液酸的比例最高可達(dá)到3%。因此CHO細(xì)胞生產(chǎn)抗體時(shí),，如果Neu5Gc唾液酸不能安全去除則可能存在引起人體免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn),。

與唾液酸類似，人類細(xì)胞單一的表達(dá)β-1,4-半乳糖,，而其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞還表達(dá)對(duì)人類具有免疫原性的α-1,3-半乳糖,，這種α-1,3-半乳糖修飾為人類異種移植豬器官帶來了阻礙。同時(shí),，鼠科細(xì)胞第NS0和Sp2/0生產(chǎn)的抗體中也可能會(huì)有這種半乳糖修飾,，這類抗體在使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)加控制，將其免疫原性降低在可授受范圍內(nèi),。

抗體已經(jīng)發(fā)展到全人源抗體,，由糖基化修飾不同引起的免疫原性應(yīng)該不再考慮。然而,，為了增加抗體的功效或是延長其半衰期,，往往會(huì)人為的引進(jìn)某些氨基酸突變、糖基化改動(dòng)等,，進(jìn)行這樣的改動(dòng)時(shí)就需要考慮其潛在的免疫原性,。并且，免疫原性不僅僅有內(nèi)因,，外部因素如物料,、多聚體的形成、表面活性劑的引入等,，均會(huì)產(chǎn)生免疫原性,。

PK/PD主要考量的是藥物在體內(nèi)作用的最小劑量及存在時(shí)間,，對(duì)于不能完全消除免疫原性的抗體，將免疫原性控制在最低顯得尤為重要,。糖基化修飾主要通過影響抗體的穩(wěn)定性及半衰期進(jìn)而對(duì)PK產(chǎn)生影響,，此外，糖基化還會(huì)影響FcRn與抗體的結(jié)合進(jìn)而影響藥物的PK,。糖基化對(duì)抗體活性的影響作用于PD,，這點(diǎn)將在下面的版塊中講到。研究抗體的PK/PD時(shí)有時(shí)還會(huì)引入清除率,，與Fc受體結(jié)合強(qiáng)的抗體的清除率低,，而糖基化會(huì)影響抗體與Fc受體或C1q補(bǔ)體的結(jié)合強(qiáng)度。如果抗體的清除率低,，與Fc受體或C1q補(bǔ)體結(jié)合的抗體可能會(huì)使免疫系統(tǒng)攻擊正常細(xì)胞,，產(chǎn)生嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)。

腫瘤治療中,，抗體發(fā)揮效力兩個(gè)重要途徑分別為抗體依賴的細(xì)胞毒性作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,，ADCC)和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用(Complement-dependent cytotoxicity，CDC),，其作用機(jī)制如圖2所示,。

圖2 ADCC和CDC作用機(jī)制

(圖表來源于參考文獻(xiàn)2)

抗體的Fc端的糖基化修飾位點(diǎn)通常是Fc受體(ADCC機(jī)制)和C1q (CDC機(jī)制)的結(jié)合位點(diǎn)，通過對(duì)糖基化的調(diào)整可以增加Fc受體和C1q與抗體的結(jié)合,，從而增加抗體ADCC和CDC活性,。

很多研究中均有報(bào)道，唾液酸糖基化修飾會(huì)影響抗體與FcγRIIa的結(jié)合,，從而降低抗體ADCC活性,。

抗體的糖基化修飾中，巖藻糖被認(rèn)為是影響ADCC活性最重要的單糖,，去巖藻糖化可以顯著提高抗體與FcγRIIIa的親和力及ADCC活性(最高達(dá)100倍),，目前的研究還沒有發(fā)現(xiàn)巖藻糖化對(duì)CDC活性的影響。如圖3,，Tsuguo Kubota團(tuán)隊(duì)通過基因手段將CHO細(xì)胞的FUT8基因(編碼巖藻糖)敲除,，生產(chǎn)不含巖藻糖殘基的抗體，發(fā)現(xiàn)其ADCC活性明顯增強(qiáng),。

圖3 抗體的去巖藻糖化及其對(duì)ADCC活性的作用

(圖表來源于參考文獻(xiàn)2)

相關(guān)體外研究中表明,，半乳糖化可以增加抗體與補(bǔ)體的結(jié)合，從而增加抗體的CDC活性,。此外,，提高半乳糖化可以提高抗體的ADCC活性，但與巖藻糖化相比只是輔助功能，半乳糖化本身對(duì)ADCC活性的作用很小,，而巖藻糖化是影響ADCC活性的主要因素,。

另外,，甘露糖化對(duì)抗體活性的影響還不是很明確,。雖然Yu團(tuán)隊(duì)的研究表明高甘露糖型可以明顯增加抗體與FcγRIIa的結(jié)合而增加ADCC活性，但是高甘露糖型中是不存在巖藻糖化的,，所以并不能明確是高甘露糖化或是去巖藻化對(duì)ADCC活性的增強(qiáng)作用,。

上面講到了不同的糖基化修飾到抗體活性的影響，那么如果Asn-297位沒有糖基化修飾呢,？到目前為此,，重鏈上高水平無糖基化修飾的抗體(highlevels of nonglycosylated heavy chain，NGHC)中還沒有發(fā)現(xiàn)其具有免疫原性,，同樣也就不具有生物活性,。NGHC型抗體完全失去了FcγRIII的結(jié)合能力，與C1q的結(jié)合能力也降低了10倍,，從而導(dǎo)致該類型抗體失去了ADCC和CDC活性,。此外，Ha等對(duì)比了半糖基化單抗(一條糖鏈)與完全糖基化單抗(兩條糖鏈)的生物活性,，與完全糖基化單抗相比,，半糖基化單抗的ADCC和CDC活性均有下降。

構(gòu)象決定性能,。糖基化修飾對(duì)抗體藥物的穩(wěn)定性和半衰期,、安全性及生物活性的影響是相互交叉的，將抗體的糖基化修飾控制在合適的范圍內(nèi),，使三者達(dá)到平衡是最佳選擇,。

參考文獻(xiàn)：

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3. Fcglycans of therapeutic antibodies as critical quality attributes,；

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