說明

具有提高治療活性的方法和成分

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及與Fc受體相互作用的改性治療蛋白質(zhì)和生產(chǎn)改性治療

蛋白質(zhì)（例如抗體）的方法,致使寡糖鏈的成分可提高抗體對其靶標(biāo)的親 合力和改變受體結(jié)合親和力并因此與未改性的抗體相比改變所述抗體 效應(yīng)子功能活性。

背景技術(shù)

抗體為先天免疫中擔(dān)任重要作用的可溶血清糖蛋白,。所有天然產(chǎn)生 抗體的碳水化合物結(jié)構(gòu)在重鏈恒定區(qū)保守位置隨著同種型的不同而變化,。各種同型具有不同排列的N-連接寡糖結(jié)構(gòu)，其可不同地影響蛋白質(zhì) 組裝,、分泌或功能活性(Wright, A.,和Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)),。參照圖1和2,連4妻N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)依賴處理的程度 可相當(dāng)大地變化，且可包括高甘露糖以及復(fù)合雙觸角的寡糖,，可有或沒 有二等分的GlcNAc和核心巖藻糖殘基(Wnght, A.,和Morrison, S. L., supra),。 一般地，在特定糖基化位點連接核心寡糖結(jié)構(gòu)具有異種的處理 方法,，恰好使單克隆抗體存在多種糖形式,。同樣地，已經(jīng)顯示在產(chǎn)生抗 體的細胞系之間出現(xiàn)了抗體糖基化的主要差異,，和甚至在不同培養(yǎng)條件 下生長的指定細胞系中觀察到次要的差異,。

已知聚糖上的唾液酸(靜電基團（static groups))在延長除抗體之外的 糖蛋白的血清半衰期中是重要的（Stockert, R. J. (1995) Physiol. Rev. 75, 591-609)。到目前為止,，單克隆抗體(Mab)上唾液酸的作用不是纟艮清楚的,。 Mab的血清半衰期是尤其長的并證明了 Fc融合蛋白的構(gòu)建在開發(fā)治療 蛋白質(zhì)例如蛋白質(zhì)enteracept中是有用的策略。

抗體和T細胞受體分子具有負責(zé)特異細胞表面受體結(jié)合的區(qū)域,，所 述結(jié)合調(diào)節(jié)細胞應(yīng)答,。免疫系統(tǒng)中，將這些功能歸類為體液的和細胞的,。 抗體常常指作銜接分子,，連接體液和細胞的免疫機制:體液應(yīng)答主要歸因 于能與耙抗原高親和結(jié)合的成熟的、分泌的,、循環(huán)抗體,。細胞應(yīng)答歸因 于細胞活化的結(jié)果，所述細胞活化可通過ab-ag復(fù)合體的結(jié)合和通過作 為復(fù)合體結(jié)合效應(yīng)細胞的結(jié)果的細胞介質(zhì)釋放所引起的下游區(qū)結(jié)局而實現(xiàn),。這些細胞應(yīng)答包括中和靶標(biāo),、調(diào)理和敏化(如果抗原位于細胞表 面）、敏化肥大細胞、和活化補體,。至于細胞耙標(biāo),即為,，細胞表面抗原，這些效應(yīng)子功能導(dǎo)致通常所稱的抗體-依賴的細胞毒性(ADCC)和補體依 賴細胞毒性(CDC),。

在抗體同型（例如IgE,、 IgD、 IgA,、 IgM,、和IgG)中，IgG類為最豐 富的,，IgGl子類顯示出效應(yīng)子功能的最顯著程度和排列,。IgGl-型抗體是 癌癥免疫療法中最常用的抗體，其中ADCC和CDC活性常常被認(rèn)為是 重要的,。結(jié)構(gòu)上,，IgG鉸鏈區(qū)和CH2域在抗體效應(yīng)子功能中擔(dān)任主要的 作用。Fc區(qū)中存在的N-連接寡糖(通過鉸鏈二聚化形成的CH2和CH3 區(qū)域)影響效應(yīng)子功能,。共價結(jié)合的寡糖為復(fù)合雙觸角型結(jié)構(gòu)且為高度異 種的（參見圖1和2),。 Asn297中保守的N-連接糖基化位點位于每個CH2 區(qū)域。在成熟的抗體中,，與Asn297連接的兩個復(fù)合雙觸角寡糖埋在CH2 區(qū)域之間,，構(gòu)成與多肽骨架的廣泛接觸。據(jù)發(fā)現(xiàn),，它們的存在是抗體介 導(dǎo)效應(yīng)子功能（例如ADCC)的要素（Lifely, M. R.,等,，Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R.,等，Immunol Rev. 163:59-76 (1998); Wright: A.和Morrison, S. L., supra),。

這些異種的寡糖包含作為末端糖的占優(yōu)勢的唾液酸,、巖藻糖、半乳 糖和GlcNAc殘基(Raju, T.S.,，等.Glycobiology 2000. 10(5): 477-86),。已 經(jīng)顯示出這些末端糖中的一些例如暴露的半乳糖、核心巖藻糖和二等分 GlcNAc的殘基,，影響ADCC活性,、CDC活性，也影響抗體對多種配體 包括Clq補體蛋白質(zhì)的結(jié)合(Presta L. 2003. Curr Opin Struct Biol. 13(4):519-25),。雖然Fc中存在的多數(shù)N-連接寡糖本性為復(fù)合雙觸角的,， 它們沒有被唾液酸化至顯著的程度(Idusogie EE,等.2000. J Immunol. 15:164(8):4178-84)。

人IgG和其它重組產(chǎn)生的IgG中發(fā)現(xiàn)的主要結(jié)構(gòu)為有或沒有Gal殘 基暴露的復(fù)合雙觸角結(jié)構(gòu)（圖1),。已經(jīng)詳細研究了含末端Gal的結(jié)構(gòu)對 抗體功能的生物學(xué)重要性的作用,?？贵w的半乳糖基化程度受到年齡、性 別和疾病的影響(Raju, T.S.,，等.Glycobiology 2000. 10(5): 477-86),。 一般 而言，寡糖結(jié)構(gòu)有一定程度的種特異性并廣泛地變化,。進一步地,，也已 經(jīng)研究了有和沒有二等分GlcNAc和核心巖藻糖殘基的寡糖結(jié)構(gòu)對生物 學(xué)重要性的影響。人IgG和多數(shù)重組產(chǎn)生的IgG包含較小量的唾液酸化 的寡糖,，然而極大多數(shù)IgG包含無唾液酸化的寡糖結(jié)構(gòu),。Ab的Fc聚糖中的唾液酸對Fc功能影響的信息是有限的，部份是由 于不能利用成對的唾液酸含量顯著不同的相同堿Mab,。據(jù)報道，從抗癌 IgGl Campath-IH(阿侖單抗)上除去唾液酸對ADCC活性沒有影響,，但是 用作參照的最初Mab制品上的Fc聚糖基具有小于10%唾液酸化,，使之 難于檢測到任何效果(Boyd等.,1995)。相似地,，Wright和Momson(1998) 報道在唾液酸化缺損的突變型CHO細胞系中表達的IgGl Ab和在野生型 CHO細胞系中表達相同的Ab之間沒有可辨別的Fc y RI結(jié)合上的差異,。 然而，來自野生型細胞系的Ab中存在的唾液酸量是相當(dāng)4氐的（Wright 等.,，2000),，因此也難于檢測到唾液酸化和無唾液酸化的Ab之間的任何 結(jié)合差異。Mimura等.（2000)比較了天然的（異種的)IgGl-Fc和IgGl Ab 相對于用唾液酸酶和P -半乳糖苷酶兩者但沒有單用唾液酸酶處理后的 相同物質(zhì)的Fc活性,，單用唾液酸酶處理才可片企-瞼唾液酸的影響,。突變 和高唾液酸化(經(jīng)oc2,3連接)的人IgG3 Ab(Lund等.，1996 supra)在補體 溶胞測定,、和FcYRI-依賴的及FcyRn-依賴的功能測定中,，比其野生型 低唾液酸化相似物^f氐2至3-倍的活性，4旦是含有混合兩種唾液酸連接（a 2,3和oc2,6)的相同Ab的高唾液酸化變體具有比得上野生型的活性 (Jassal等.,，2001 Biochem Biophys Res Comm 286:243-249),。雖然證實唾 液酸連接類型對突變型IgG3 Ab的Fc功能可至少具有一些影響，但研 究沒有比較高含量唾液酸的IgG與低含量唾液酸的IgG的Fc功能,。

因此,，對寡糖結(jié)構(gòu)中與免疫球蛋白恒定區(qū)連接的唾液酸成分作用的 系統(tǒng)分析是正當(dāng)?shù)摹Ｖ委熆贵w的預(yù)表達基因工程或表達后修飾的可用技 術(shù)給出后,，該信息可用于提高和進一步匹配由該類型生物藥劑學(xué)對鄰近 的初始耙標(biāo)和疾病適應(yīng)證所誘出的細力包應(yīng)答,。

發(fā)明概述

本發(fā)明包含優(yōu)化含F(xiàn)c分子的體液和細胞免疫功能的方法，尤其為 抗體治療法,。

本發(fā)明包含控制含F(xiàn)c分子性質(zhì)的方法,，其包含改變(對生型增加或 減少)Fc區(qū)寡糖的唾液酸化以控制分子對多種局部靶蛋白質(zhì)的親合力,； 對一種或多種Fc y受體(例如Fc y ri、 Fc y riia,、和Fc y riiia受體） 的親和力,；ADCC活性；巨噬細胞或單核細胞活化,；和血清半衰期,。

通過酶處理、酶改性分子,、基因操縱分子,、凝集素色語法、親和色i普法,、離子交換色語法,、疏水作用色譜法、尺寸排阻色譜法,、用于表達 蛋白質(zhì)的細胞系的特定選擇或基因工程,、用于含有能修飾寡糖的酶或這酶的抑制劑的血清或環(huán)境(mileu)中產(chǎn)生含有Fc蛋白質(zhì)的宿主細胞培 養(yǎng)，和將蛋白質(zhì)暴露給多種pH環(huán)境,，可以改變聚糖唾液酸化作用,。

本發(fā)明也涉及高度同種的批抗體的制備，所述抗體包含F(xiàn)c區(qū)內(nèi)最 大唾液酸化的N-連接寡糖,。本發(fā)明進一步涉及批抗體的純化,，以富集含 唾液酸的Fc寡糖抗體以及不含唾液酸的Fc寡糖抗體。

更具體而言,，本發(fā)明涉及宿主細胞或在細胞培養(yǎng)基或在體外操縱糖 基轉(zhuǎn)移酶(唾液酸轉(zhuǎn)移酶)或唾液酸酶活性的方法,，以影響合成重組表達 單克隆抗體或其它含有Fc的融合蛋白的唾液酸化水平，所述方法使合 成重組表達蛋白質(zhì)具有適當(dāng)最佳化的（i)Fc介導(dǎo)的效應(yīng)子功能,，（ii)FcY 受體結(jié)合,，（iii)改變的ADCC (lv)與重組表達的含有Fc^f旦沒有優(yōu)化唾液 酸含量的多肽相比的血清半衰期或(v)對位于天然或合成排列的靶分子 親合力。

附圖若干視圖的簡述 圖1為人IgG中發(fā)現(xiàn)的最大量寡糖結(jié)構(gòu)的概要敘述,。 圖2描述中國倉鼠卵巢(CHO)細胞生產(chǎn)的重組IgG中發(fā)現(xiàn)的主要寡 糖的結(jié)構(gòu),。

圖3展示HPLC檢驗Fc寡糖的結(jié)果。通過肽-N-聚糖酶F(PNGase F) 酶處理,，N-連接寡糖首先從抗體中釋放出來,。將釋放的寡糖用鄰氨基苯 曱酸標(biāo)記，并將標(biāo)記的寡糖通過凝膠過濾色譜法純化,。將純化標(biāo)記的寡 糖通過HPLC分析,，結(jié)果展示于色譜圖中。

圖4A和4B的曲線圖展示不同Abl的結(jié)合:K562細胞上通過兩種不 同形式對人FcyRII的免疫復(fù)合,。（A)竟?fàn)幗Y(jié)合,，通過在固定量的與Ab6 復(fù)合的251-標(biāo)記的人IgGl Ab5(Ab5特異性小鼠單克隆的Ab)存在下,，向 細胞加入不同量的未標(biāo)記的Abl和TNF的復(fù)合體進4于測量。（B)直接結(jié) 合,，通過向K562細胞加入與]251-標(biāo)記TNF復(fù)合的不同量的Abl進行測 量,。

圖5A-D為多種測試Ab制品的Fc y RIIIa結(jié)合實-驗的曲線圖，所述 制品用于竟?fàn)幰怨潭舛冉Y(jié)合NK-細胞Fc y RIIIa的放射標(biāo)記的抗Fc y RIIIa mAb 3G8:Abl天然糖基化變體(A);Ab5天然糖基化變體CB);Abl凝集素柱部分(C);和Ab2凝集素柱部分(D),。

圖6A-D的曲線圖展示在細胞表面過度表達TNF的K2耙細胞和表 達Fc Y R的人PBMC效應(yīng)細胞上應(yīng)用不同唾液酸含量的Abl進行的體 外ADCC測定的結(jié)果,。（A)Abl天然糖基化變體，（B)Ab5天然糖基化變 體,，（C)基于WGA凝集素親和力分級分離的唾液酸含量不同的三子批 (sublot)Abl和酶脫糖基化的（Gno)Abl的比較,(D)未處理的Abl樣品和完 全唾液酸化的Abl G2S2樣品或Ab7同型配對的陰性對照Ab的比較,。 以一式三份(誤差條表示s.d.)分析樣品，所示結(jié)果代表各對變體的三個獨 立試驗,。當(dāng)通過平方和增量(extra sum of squares)F檢驗確定時,，這些測 試樣品之間的活性差異是顯著的（曲線圖A、 C,、和D,， P〈0.0001;曲線 圖B, P = 0.0016)。

圖7A和B的曲線圖展示多種IgG抗體樣品在U-937細胞上對人Fc yRI (CD6々)受體的竟?fàn)幮越Y(jié)合,，（A) Abl G2(完全半乳糖化和無唾液酸 化)和AM G2S2(hi)(完全半乳糖化和完全唾液酸化)只有唾液酸存在和不 存在的差別,(B)兩種不同批的帶電荷不同量的寡糖種類（含有唾液酸的 種類）的Ab3,分別為總寡糖的2%或42%。

圖8的曲線圖展示施用后的時間和完全地唾液酸化(G2S2)或未改性 的Fc部分的融合蛋白（FcPl)的血清濃度之間的關(guān)系,。

圖9的曲線圖按照所述的酶方法,，展示施用后的時間和完全地唾液 酸化Ab2 G2S2或完全無唾液酸化Ab2 G2的Fc部分的血清濃度之間的 關(guān)系。

圖10A-D的曲線圖通過與放射標(biāo)記的Ab竟?fàn)幮越Y(jié)合,，展示Ab制 品中的唾液酸對細胞表面耙配體的親和力的影響:(A) Abl天然變體,，（b) Ab5天然變體，（C)Abl凝集素-柱部分變體,，和(D)Ab2凝集素柱部分變 體,。樣品以雙份或四份進行試驗，所示結(jié)果代表3或4個獨立試驗,。當(dāng) 通過平方和增量的F檢驗確定時,，這些測試樣品之間的結(jié)合差異是顯著 的（曲線圖A、 C,、和D, P< 0.0001),。

圖11A-B的曲線圖展示Ab制品中的唾液酸對EIA板涂布的耙配體 的親和力的影響:(A)與TNF結(jié)合的AM天然變體，（B)與抗Id抗體結(jié)合的 Ab2,。

圖12A-C為曲線圖,，展示Ab制品中的唾液酸對以放射標(biāo)記的可溶 性表面結(jié)合Ab的抗原存在的靶配體的親和力的影響:(A) Ab 1天然變體，(B)Abl 1凝集素-柱部分變體,，和(C)Ab2凝集素-柱部分變體,。進行放射 標(biāo)記的Ag和100-倍過量未標(biāo)記的Ag對照孵育,，以測定非特異性結(jié)合。 樣品以三份進行試驗,。

本發(fā)明詳述

縮寫

oc 1,3GT,， a -1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；a 2,3ST, oc -2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶,；P 1,4GT, |3 -1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶;八0(^:,抗體-依賴的細胞毒性;八11(:(:,美國 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)收集所;BATDA,雙（乙酰氧甲基)2,2':6',2"-三聯(lián)吡啶-y,y"-二羧酸 鹽;BSA,牛血清白蛋白;CD培養(yǎng)基,，化學(xué)定義的培養(yǎng)基;CDC,補體直接的 細胞毒性；CMPSia,—磷酸胞苷-N-乙酰神經(jīng)氨糖酸,；DMEM,達爾伯克改 良伊格爾培養(yǎng)基;E:T,效應(yīng)細胞對粑細胞的比例：FBS,胎牛血清,；ESI-MS, 電噴射離子質(zhì)譜法;NK細胞,天然殺傷細胞;IgG,免疫球蛋白G;IMDM,伊 思考夫改良達爾伯克培養(yǎng)基；MALDI-TOF-MS,基質(zhì)輔助的激光/解吸電 離飛行時間質(zhì)鐠法,；MHX,麥考酚酸,次黃噤呤,、黃嘌呤；NANA,唾液酸 的N-乙酰神經(jīng)氨糖酸的同分異構(gòu)體;NGNA,唾液酸的N-羥乙?；窠?jīng)氨 酸的同分異構(gòu)體;PBMC,外周血單核細胞,；PBMC，外周（periphemll)血單 核細胞;PBS,磷酸緩沖鹽溶液;PNGase F,肽-N-糖苷酶F;RP-HPLC,反相高 效液相色譜法,；RT,室溫,；Sia,唾液酸；UDP-Gal,尿苷二磷酸-半乳 糖;UDP-Glc N Ac,，尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺,。

定義

本文所用的術(shù)語"親和力，,，旨在表示筒單的單價配體（simple monovalent ligand)對其相應(yīng)的結(jié)合配偶體的結(jié)合(例如Fab'對抗原或表 位的結(jié)合)常數(shù)的量度,。親和力可用幾種方法測量，包括例如通過等離子 體共振法(BmCore)測量結(jié)合以及分離的速率(分別為k,。n和koff),且親和力可表達為全部締合(Kass)或解離常數(shù)(Ko),其中K^為k口koff和KD為koff/k,。n。也可以經(jīng)驗地例如通過測量配體與結(jié)合配偶體為半飽和結(jié)合時 的濃度,，測量Kd,。測量KD的另一種方法為通過竟?fàn)帨y定法，其中將一 種結(jié)合劑或配體標(biāo)記或標(biāo)識并保持恒定的濃度,，而以不同的濃度加入測 試結(jié)合劑或配體,，以同標(biāo)記物質(zhì)竟?fàn)?吏之乂人其相應(yīng)結(jié)合配偶體上離去并 測定標(biāo)記物減少 一半時的濃度。

ii本文所用的術(shù)語"親合力,，,，旨在表示配體保持與配偶體結(jié)合在配體 和結(jié)合配偶體兩者多價結(jié)合范圍內(nèi)的趨向和對特異性配體可同時發(fā)生 多重締合和解離事件趨向的量度。因此親合力通過增加已知親和力的結(jié) 合配偶體的多價構(gòu)造的表觀親和力,，可測量親合力,。

本文所用的術(shù)語"含有Fc的蛋白質(zhì)"或"含有Fc的分子"是指單體的,、二聚體的或異二聚體的蛋白質(zhì)，具有配體結(jié)合域和至少免疫球蛋白的CH2和CH3域,。CH2和CH3域可至少形成該蛋白質(zhì)/分子(例如抗 體)的二聚體區(qū)域的一部分,。

術(shù)語"抗體"旨在包括抗體、消化片斷,、特定部分和其變體,，其包 括但不限于抗體模擬物或包含模擬抗體或其特定片斷或部分的結(jié)構(gòu)和/ 或功能的抗體部分，其保留了Fc介導(dǎo)的功能,，包括但不限于:結(jié)合Fc受 體（例如FcyRI (CD64),、 FcyRIIA (CD32A)、 Fc y RIIIA (CD16A)和 FcRn),、結(jié)合補體(例如Clq),、 ADCC和CDC。

本文所用的術(shù)語"單克隆抗體"為含有Fc融合蛋白的特異形式,， 其中配體結(jié)合域保留至少 一種動物抗體的至少 一個重鏈或輕鏈抗體可 變域的基本同源性,。

術(shù)語"唾液酸"是指九碳羧酸糖家族的任何成員。唾液酸家族最通 常的成員為仆乙酰神經(jīng)氨酸(2-氧代-5-乙酰胺基-3,5-雙脫氧-0-甘油隱0-半乳壬碳外匕喃糖-1 -酸(galactononulopyranos-1 -onic acid))(通?？s寫為 Neu5Ac,、 NeuAc、或NANA),。該家族第二個成員為N-羥乙?；?神經(jīng)氨 酸(NGNA、 Neu5Gc或NeuGc),，其中NeuAc的N-乙酰基基團被羥基化,。 該形式在嚙齒類動物和微生物來源的糖蛋白中是普遍的,。第三個唾液酸 家族成員為尤羅索尼克酸（2-氧代-3-脫氧-壬碳糖酸（nonulosonic acid))(KDN)(Nadano等.（1986)丄Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori等.，J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)),。也公開了 9-取代 的唾液酸例如9-0-C-C6?；鵑eu5Ac,像9-0-乳酰基-Neu5Ac或9-0-乙?；?Neu5Ac,、 9-脫氧-9-氟-Neu5Ac和9-疊氮基-9-脫氧-Neu5Ac。至于 靜電酸(static acid)家族的綜述,，參見例如,，Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer Verlag, New York (1992))。

葛述出乎意料地發(fā)現(xiàn)了 Fc寡糖唾液酸化的水平可改變重組生產(chǎn)的治療性抗體對FcY受體的親和力,，導(dǎo)致所述抗體生物作用的多方面調(diào)整,。更 具體地說,，發(fā)現(xiàn)了高度唾液酸化的Ab對低親和性受體Fc y riia(cd32a) 和Fc Y RIIIA(CD1 6A)具有顯著減少的親和力，且在體外ADCC測定(據(jù) 相信Fc Y RIIIA為其中有關(guān)的受體）中具有顯著減少的活性,。進一 步發(fā)現(xiàn) 了高度唾液酸化的Ab對高親和性Fc Y受體-Fc yRI(CD64)具有增加的親 和力,，且當(dāng)與無唾液酸化或部分唾液酸化的含有Fc蛋白質(zhì)比4支時，完 全唾液酸化的含有Fc的蛋白質(zhì)具有降低的血清半衰期,。

進一步發(fā)現(xiàn)了從Fc寡糖上除去（或缺失或降低的水平)唾液酸可提 高重組生產(chǎn)的治療性抗體對其粑分子的親合力,。雖然不希望受限于任何 一種理論，可將從寡糖上除去帶電荷的靜電基團解釋為使整體抗體結(jié)構(gòu) 更具柔性,，所述柔性在彼此聯(lián)系的兩個結(jié)合區(qū)域中提供潛在相互作用更 大的范圍,。Ab的二價(bivalently)結(jié)合兩種抗原表位的能力也將依賴于表 位的可近性、方向,、密度,、和流動性。應(yīng)當(dāng)注意到唾液酸化對結(jié)合抗原 的影響也可與Ab相關(guān),，所述Ab識別病毒或細菌表面抗原和甚至為均聚 物的可溶性抗原,，因為Ab柔性可決定可溶性免疫復(fù)合物內(nèi)個體Ab分子 的二^j^結(jié)合程度的多少，其中一些Ab不^5l可以結(jié)合一種以上的抗原,， 而且一些抗原可以;故一個以上的Ab結(jié)合,。

本發(fā)明包含控制含F(xiàn)c分子性質(zhì)的方法，它通過改變Fc'寡糖的唾液 酸化作用和含改變的Fc分子,。唾液酸在生理學(xué)pH時具有凈負電荷,，因 此在Fc結(jié)合的碳水化合物中唾液酸的存在預(yù)期會改變?nèi)S結(jié)構(gòu)因而構(gòu) 造ch2域,并因此影響Fc與多種配體或受體的結(jié)合。含有改變的Fc分 子可影響一種或多種FcyRI,、 FcyRIIA,、和FcyRIIIA受體的親和 力,ADCC活性，巨噬細J包或單核細胞活化,，和血清半衰期,。

含有Fc蛋白質(zhì)的唾液酸化形式的富集一種制備唾液酸含量不同的含有特定Fc的蛋白質(zhì)子批的方法是取 具有異種Fc寡糖（包括唾液酸化和無唾液酸化兩種分子）的含有Fc的蛋 白質(zhì)制品，使之通過含有固定凝集素的柱,，所述凝集素柱對唾液酸化和 無唾液酸化寡糖具有差別的親和力,。非結(jié)合流動經(jīng)過(T,經(jīng)過)或柱非結(jié) 合的部分可與結(jié)合部分(B,結(jié)合)分離，后者通過洗脫緩沖劑經(jīng)過柱而收 集,。例如通過在用初始樣品緩沖劑連續(xù)清洗柱期間收集洗脫的含有Fc的蛋白質(zhì),，也可能單獨地收集弱結(jié)合部分或柱延滯部分(R,延滯)。取決 于所用的凝集素,，非結(jié)合部分可比結(jié)合的部分具有更高或更低的唾液酸含量,。

可富集含有唾液酸化和無唾液酸化Fc蛋白質(zhì)的凝集素實例為懷槐 (Maacha awwrm^)凝集素(MAA),其特異地結(jié)合末端唾液酸寡糖；和 麥胚凝集素（WGA)其特異地結(jié)合末端唾液酸或末端N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)的寡糖。另一個實例為蓖麻凝集素(RCA),其與末端半乳糖寡 糖結(jié)合,。在較后的實例中,，非結(jié)合流動經(jīng)過的部分可以用于富集含有唾 液酸化Fc的分子。

含有Fc的蛋白質(zhì)的酶修飾

另制備唾液酸含量不同的含有特定Fc的蛋白質(zhì)子批的方法是用唾 液酸酶處理含有Fc的蛋白質(zhì)制品部分,，從而除去唾液酸,。可比較所得 到的無唾液酸化的物質(zhì)與初始的,、部分唾液酸化的物質(zhì)在生物活性中的 差別,。初始含有Fc的蛋白質(zhì)批中唾液酸含量越高，檢測到生物活性中 的任何差別的機會越大,。例如,，如果初始蛋白質(zhì)制品只有10Q/qFc寡糖含 唾液酸，在唾液酸酶處理后（0-1%寡糖含唾液酸)可能難于纟企測到生物活 性中的差別,。如果唾液酸酶處理導(dǎo)致巖藻糖化和無巖藻糖化 (afucosylated)的寡糖分布不同,，那么比較含有Fc的蛋白質(zhì)在唾液酸酶處 理前和后的生物活性將會更加困難，因為巖藻糖水平對某些生物活性諸 如對人FcyRIIIA的親和性和ADCC活性具有極大的影響,。例如,，如果 將唾液酸含量從30%寡糖減少至0%,導(dǎo)致無巖藻糖化寡糖的比例從5% 增加至15%,那就不可能將ADCC活性的差別單獨地歸因于唾液酸含量 的減少。唾液酸酶處理可能影響巖藻糖化和無巖藻糖化寡糖的相對比例 (并且已經(jīng)觀察到）,，因為在用唾液酸酶處理以除去唾液酸殘基之前,，存 在巖藻糖化和巖藻糖化寡糖的唾液酸化差異。

存在于Fc區(qū)的唾液酸4匕寡糖也可應(yīng)用體外糖基化方法來實現(xiàn),。應(yīng) 用這種方法,，可能獲得抗體樣品最大唾液酸化的糖形（glycoform)?；?申請人的發(fā)現(xiàn),，當(dāng)與無唾液酸化或唾液酸化不足的抗體相比時,抗體或其 它含有Fc構(gòu)造的最大唾液酸化的糖形具有減少的血清半衰期。因此,， 本發(fā)明的方法提供了控制包含抗方法,。

糖基轉(zhuǎn)移酶天然的功能是合成寡糖。它們產(chǎn)生特異的產(chǎn)物,，具有極好的立體化學(xué)和區(qū)域化學(xué)幾何學(xué)（regiochemical geometry),。糖基殘基的 轉(zhuǎn)移導(dǎo)致寡糖或多糖的延長或合成,。已經(jīng)描述了許多糖基轉(zhuǎn)移酶類型,， 包括唾液酸轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶,、N-乙酰半乳糖 氨基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶等。

用于本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶包括例如oc -唾液酸轉(zhuǎn)移酶,、a -葡糖轉(zhuǎn)移 酶,、a-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、cc-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,、a-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶,、a -木糖基轉(zhuǎn)移酶、a -N-乙酰己糖氨基轉(zhuǎn)移酶 (acetylhexosaminyltransfemses),、 p陽唾液酸轉(zhuǎn)移酶,、P-葡糖轉(zhuǎn)移酶、P-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶,、P-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,、P-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、P-木糖基 轉(zhuǎn)移酶,、和P-N-乙酰己糖氨基轉(zhuǎn)移酶,，例如來自腦膜炎奈瑟球菌 (Neisseria meningitides)或其它細菌源的那些糖基轉(zhuǎn)移酶，和來自大鼠,、 小鼠,、兔、牛,、豬,、人類和昆蟲病毒源的那些糖基轉(zhuǎn)移酶,。優(yōu)選地,，糖 基轉(zhuǎn)移酶為其中切除結(jié)合膜的區(qū)域的平截變體糖基轉(zhuǎn)移酶。

示例性半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括ot (1,3)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(E.G. No. 2.4.1.151,參見,，例如,，Dabkowski等.,，Transplant Proc. 25:2921 (1993)和 Yamamoto等.Nature 345:229-233 (1990))和a (1,4)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C. No. 2.4.1.38)?？蓱?yīng)用其它的糖基轉(zhuǎn)移酶,，例如唾液酸轉(zhuǎn)移酶。

a(2,3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶通常稱作唾液酸轉(zhuǎn)移酶,，可用于產(chǎn)生唾液酸乳 糖或更高級別的結(jié)構(gòu),。該酶從CMP-唾液酸上轉(zhuǎn)移唾液酸(NeuAc)至半乳 糖(Gal)殘基，并在所述兩個糖之間形成oc-連接,。糖之間的鍵合(連接） 位于NeuAc的2-位和Gal的3-位之間,。示例性oc (2,3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶是指 唾液酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.99.6),其將唾液酸轉(zhuǎn)移至Gal P l—〉3Glc 二糖或糖 苷的非還原末端Gal的a(2,3)。參見,，Van den Eijnden等,，J. Biol. Chem., 256:3159 (1981), Wemstem等.,，J. Biol. Chem., 257:13845 (1982)和Wen 等.，J. Biol. Chem., 267:21011 (1992),。另 一個示例性ct-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶 (EC 2.4.99.4)將唾液酸轉(zhuǎn)移至二糖或糖苦的非還原末端Gal,。參見, Rearick等.，J. Biol. Chem., 254:4444 (1979)和Gillespie等.,，J. Biol. Chem., 267:21004 (1992),。進一步的示例性酶包括Gal-P-1,4-GlcNAc a -2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶(參見，Kurosawa等.Eur. J. Biochem. 219: 375-381 (1994)),。具體用于制備本發(fā)明寡糖的其它葡糖轉(zhuǎn)移酶為甘露糖基轉(zhuǎn)移酶包括a(l,2)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶,、oc(l,3)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、P(l,4)甘露糖基轉(zhuǎn) 移酶,、Dol-P-Man合酶,、OChl、和Pmtl,。

其它葡糖轉(zhuǎn)移酶還包括N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶包括oc(l,，3)N-乙 酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶、P (1,4)N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶(Nagata等.J. Biol. Chem. 267:12082- 12089 (1992)和Smith等.J. Biol Chem. 269:15162 (1994))以及多肽N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶(Homa等.J. Biol Chem. 268:12609 (1993)),。適用的N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶包括GnTI (2.4.1.101, Hull等.,，BBRC 176:608 (1991)), GnTII,和GnTIII (Hiara等. J. Biolchem. 113:692 (1993》，GnTV (Shoreiban等.J. Biol. Chem. 268: 15381 (1993》,。

至于其中以商業(yè)規(guī)模實施本方法的那些實施方案,，將糖基轉(zhuǎn)移酶固 定在支撐上可能是有利的。這種固定容易使酶從批產(chǎn)品中除去且有利于 酶以后的再使用,。例如通過除去轉(zhuǎn)移酶的膜結(jié)合區(qū)域并在其位置連接纖 維素結(jié)合區(qū)域,，可以實現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶的固定。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解 也可以應(yīng)用其它的固定方法,，這些方法描述在可用的文獻中,。

因為受體底物基本上為含有對特定糖基轉(zhuǎn)移酶顯示特異性的末端 糖殘基的任何單糖或寡糖，底物可以在其非還原端位置被取代,。因此,， 糖甙受體可以為單糖、寡糖,、熒光標(biāo)記的糖,、或糖衍生物，諸如包括抗 體和其它含有Fc蛋白質(zhì)的氨基糖甙抗生素,、神經(jīng)節(jié)糖苷或糖蛋白,。在 一組優(yōu)選的實施方案中，糖戒受體為寡糖,，優(yōu)選地,，Gal p (l-3)GlcNAc、 Gal |3 (l-4)GlcNAc,、 Gal P (l-3)Ga脆c,、 Gal P (l-4)GalNAc、 Man a (1,3)Man,、 Man a(l,6)Man,、或GalNAc (5 (l-4)-甘露糖。在尤其優(yōu)選的 實施方案中,，寡糖受體與含有Fc的蛋白質(zhì)的CH2區(qū)域連接,。

通過應(yīng)用與糖基轉(zhuǎn)移酶（glycoltransferase)反應(yīng)并發(fā)的再生反應(yīng)（又 稱再循環(huán)系統(tǒng)），可防止利用活化的糖底物即糖-核苷磷酸鹽,。例如美國 專利6,，030,815中所教導(dǎo)的，CMP-唾液酸再循環(huán)系統(tǒng)利用CMP-唾液酸 合成酶來補充CMP-唾液酸(CMP-NeuAc),因為它在a (2,3)唾液酸轉(zhuǎn)移 酶存在下與唾液酸轉(zhuǎn)移酶受體反應(yīng),，形成唾液酸化糖,。本發(fā)明所用的 CMP唾液酸再生系統(tǒng)包含一磷酸胞苦(CMP)、三磷酸核苦(例如三石壽腺 苦(ATP),、磷酸鹽供體(例如磷酸烯醇丙酮酸或乙酰磷酸),、能夠從磷酸鹽 供體轉(zhuǎn)移磷酸鹽至二磷酸核苦的激酶(例如丙酮酸激酶或醋酸鹽激酶)以16及能夠從三磷酸核苷轉(zhuǎn)移末端磷酸鹽至CMP的核苦單磷酸激酶(例如肌激酶）。oc(2,3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶和CMP唾液酸合成酶也可纟皮看作是CMP 唾液酸再生系統(tǒng)的 一部分,，因為活化唾液酸的除去利于維持合成的推進 速度,。1992年10月1日公布的國際申請WO 92/16640公開了應(yīng)用包含 改性CMP唾液酸合成酶基因的噬菌粒在唾液酸化過程中的唾液酸化合 物合成和用途。

制備寡糖的替代選擇性方法可如同美國專利5,952,203所教導(dǎo),，應(yīng) 用糖基轉(zhuǎn)移酶和作為糖供體的活化糖基衍生物,，而不需要糖核苷酸作為 糖供體?；罨奶腔苌镉糜谔娲烊淮嬖诘牡孜?，所述底物為昂貴 的糖核苷酸，通常為核苷酸二磷酸糖或核苷酸單磷酸糖,，其中核苷酸磷 酸鹽與糖1-位置為cc-連接,。

有用的活化的糖苷衍生物包括活化的離去基團，例如氟,、氯,、溴、 曱苯磺酸酯,、甲磺酸酯,、三氟曱磺酸酯（triflate ester)等?；罨擒昭?生物的優(yōu)選實施方案包括氟代糖（glycosyl fluorides)和曱磺酸糖基酯 (glycosyl mesylates),尤其優(yōu)選的為氟代糖,。在氟代糖中,，最優(yōu)選的為氟 代a-半乳糖、氟代a-甘露糖,、氟代a-葡萄糖,、氟代a-巖藻糖、氟代cx -木糖,、氟代a-唾液酸,、氟代a-N-乙酰氨基葡糖、氟代a-N-乙酰氨基半 乳糖,、氟代P -半乳糖,、氟代p -甘露糖、氟代P -葡萄糖,、氟代P -巖藻糖,、 氟代P -木糖、氟代P -唾液酸,、氟代P -N-乙酰氨基葡糖和氟代P -N-乙酰 氨基半乳糖,。

通過首先將糖乙酰化然后用HF/吡咬處理,，可由游離糖制備氟代糖,。 通過與于曱醇中的弱（催化性)堿(例如NaOMe/MeOH)反應(yīng)，可以將乙酰 化的氟代糖脫保護,。而且,，多數(shù)氟代糖是商業(yè)上可得到的。其它活化的 糖基衍生物可應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制得,。例如,，曱磺酸 糖基酯可通過用甲磺酰氯處理完全千化半縮醛形式的糖，隨后通過催化 氬化除去千基制得,。

該反應(yīng)進一步的成分為催化劑量的磷酸核苷或其類似物,。本發(fā)明適 用的一磷酸核普包括例如一磷酸腺苷(AMP)、 一磷酸胞普(CMP),、 一磷 酸尿苷(UMP),、 一磷酸鳥苦(GMP)、 一磷酸肌苷(IMP),、和一磷酸胸苦 (TMP),。根據(jù)本發(fā)明所適用的三磷酸核苷包括三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸 胞苷(CTP),、三磷酸尿苷(UTP),、三磷酸鳥苷(GTP)、三磷酸肌苷(ITP)和 三磷酸胸苦(TTP),。優(yōu)選的三磷酸核苷為UTP,。優(yōu)選地,，磷酸核苷為二磷酸核苷，例如二磷酸腺苷(ADP),、二磷酸胞苷(CDP),、二磷酸尿苷(UDP)、 二磷酸鳥苷(GDP),、 二磷酸肌苷(IDP)和二磷酸胸苷(TDP)。優(yōu)選的二磷 酸核苷為UDP,。如上所述,，也可用磷酸核苷的類似物實施本發(fā)明。適合 的類似物包括,，例如核苷硫酸鹽和磺酸鹽,。其它的類似物還包括簡單的 磷酸鹽，例如焦磷酸鹽,。

一種在例如鼠細胞(其中唾液酸的羥基化物形式占優(yōu)勢(NGNA))中 產(chǎn)生改性重組蛋白質(zhì)的方法是用唾液酸酶處理蛋白質(zhì),，除去NGNA-型唾 液酸，隨后用試劑UDP-Gal和P -1,4-Gal轉(zhuǎn)移酶進行酶的半乳糖基化,， 產(chǎn)生高度同種的G2糖形,。該制品然后可任選地用試劑CMP-NANA和 a-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理，得到高度同種的G2S2糖形,。

唾液酸變體的結(jié)構(gòu)特征

至于含唾液酸變體寡糖的結(jié)構(gòu)特征,，將包括抗體制品的糖蛋白制品 用肽-N-糖苦酶F處理以釋出N-連接的寡糖。酶肽-N-糖苷酶F(PNGase F) 可分開天冬酰胺連接的寡糖,。將釋出的寡糖用鄰氨基苯甲酸(2-氨基苯甲 酸）標(biāo)記熒光,，通過所述的HPLC(參見Anumula, K. R.和Dhume ST Glycobiology. 1998 Jul;8(7):685-94)進行純化和分析。如圖3所示,，寡糖 在色譜圖中分離為可檢測和定量的GO,、 Gl、 G2,、 G2S1和G2S2,。糖基 化的種類-天然缺乏聚糖的或具有被化學(xué)或酶分解的聚糖被指定為Gno 。

唾液酸變體的生物學(xué)特征

通過幾種眾所周知的體外分析,，可比較含有Fc蛋白質(zhì)的功能性,。 尤其感興趣的是Fc y受體的Fc yRI、 FcyRII,、和FcyRIII家族成員的 親和性,。應(yīng)用受體的重組可溶形式或受體細力包相關(guān)的形式，可進4亍這些 測量,。此外,，例如通過BIAcore應(yīng)用重組可溶的FcRn,，可測量FcRn(負 責(zé)延長IgG循環(huán)半衰期的受體）的親和性?；诩毎墓δ軠y定諸如 ADCC測定和CDC測定,，提供了洞察特定變體結(jié)構(gòu)的功能結(jié)果的可能 性。在一個實施方案,，ADCC測定中配置有NK細胞充當(dāng)初級的效應(yīng)細 胞,，從而反映出對Fc yRIIIA受體的功能影響。也可應(yīng)用吞噬作用試驗 以比較不同變體的免疫效應(yīng)子功能,，因為實驗可測量細胞應(yīng)答諸如過氧 化物或炎癥介質(zhì)的釋放,。親和力和親合力的測定可測試天然多價抗體以確定其與靶蛋白質(zhì)結(jié)合的多種參數(shù)。測定表觀Kd方便的形式為ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定）或RIA(放射性免疫測 定）,。"ELISA"通常被用于表示在固體載體上應(yīng)用間接測定方法所進行的 結(jié)合測定,。 一般地，在ELISA中,，在與固相反應(yīng)物特異性結(jié)合后,，將可 溶性分析物從溶液中分離。在這種方法中,，通過在塑料微孔板上吸附抗 原或抗體制得固相反應(yīng)物,；在其它方法中，固相反應(yīng)物為細胞相關(guān)的分 子,。在所有的方案中,，將固相反應(yīng)物與酶共價偶聯(lián)的第二或第三反應(yīng)物 一起孵育。通過清洗除去非結(jié)合的偶聯(lián)物,，并加入發(fā)色或熒光 (fluorogenic)的底物,。由于底物被結(jié)合的酶偶聯(lián)物所水解，產(chǎn)生了有色的 或熒光的產(chǎn)物,。最后,，在視覺上或用微孔板讀數(shù)器檢測產(chǎn)物。所產(chǎn)生的 信號強度與試驗混合物中最初分析物的量成比例,。

在固相測定的變體中,，可間接地固定或俘獲抗原，例如應(yīng)用可識別 抗原無關(guān)結(jié)構(gòu)域的固定俘獲的抗體,，或通過應(yīng)用抗體或其它的配體,，其 與靶蛋白質(zhì)(例如多組氨酸序列）中設(shè)計的"tag"結(jié)合。

測量表面抗原抗體結(jié)合的替代選擇性方法是應(yīng)用整體細胞,，其在細 胞表面表達(天然地或通過基因工程)抗原,。將這些細胞與含初始抗體的 試驗溶液一起孵育。將非結(jié)合的抗體洗掉，然后將細胞與酶偶聯(lián)物一起 孵育,，以獲得初始抗體的特異性抗體,。將非結(jié)合的酶偶聯(lián)物洗掉，然后 加入底物溶液,。結(jié)合初始抗體的水平與底物水解的量成比例,。如果每單 位體積的細胞數(shù)保持不變，則可定量,。替代選擇地,，通過如上所述的直 接結(jié)合或竟?fàn)帲瑧?yīng)用放射標(biāo)記配體進行測定,。ELISA測定的方案參見于 例^口 In: Ausebel, FM等.Cw/re"f尸n7toco/s & Mo/ecw/ar Szo/ogy. 2003 John Wiley & Sons, Inc,。

應(yīng)用固相結(jié)合劑或配體以及流動液相結(jié)合劑或配體的BIAcore技 術(shù)，通過表面等離子體共振法檢測,，可測量結(jié)合速率,、締合速率和離解 速率,。

f#潔好才法

由于抗體糖基化在清除率中的作用,，因此含有治療性Fc蛋白質(zhì)的 藥動學(xué)似乎是最小限度的（mimmal);與新生的Fc受體(FcRn)的結(jié)合被認(rèn) 為是負責(zé)從循環(huán)中除去IgG,似乎不受抗體Fc部分上缺乏N-連接寡糖的干擾。

連接IgG抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答與細胞效應(yīng)子功能的IgG Fc受體(FcR) 包括Fcy受體:FcRI (CD64),、 FcRII(CD32)(FcRIIA和FCRIIB兩種）,、和 FcRIII (CD16)。所有三者均發(fā)現(xiàn)在單核細胞上顯示,。然而,，在各種靶細 胞上這些受體的精細之處似乎出現(xiàn)差異并與其它因素對應(yīng)。因此,，含糖 基化修飾Fc的生物治療藥物對Fc Y受體的親和性測量是適用于預(yù)測提 高效應(yīng)子功能的測量,。

據(jù)報道，在其Fc聚糖上含低水平巖藻糖的人IgGl Ab對人CD 16 FcR具有更大的親和性,，且在應(yīng)用人PBMC效應(yīng)細胞的ADCC測定中顯 著地提高體外活性(Shinkawa等.J Biol Chem 278(5):3466畫3473, 2003; Shields等.J Biol Chem 277(30):26733-26740,， 2002; Umana等.，Nat Biotech 17:176-180,1999),。

應(yīng)用體外ADCC測定,，可以定量的方式進行效應(yīng)子功能的評價方 法。因此,，體外測定可以設(shè)計為測量結(jié)合抗體引起細胞破壞的能力,，其 中通過正確選拷4巴和效應(yīng)細胞系顯示其近親配體和通過使細l包無力繼 續(xù)分化或通過內(nèi)容物的釋放例如"Cr釋放評價細胞"殺死"。粑細胞可以 是對本發(fā)明的抗體,、抗體片段,、或融合蛋白正常表達靶配體的細胞系， 或可以是設(shè)計為在其表面表達和保留靶蛋白質(zhì)的細胞系。這樣設(shè)計的細 胞系實例為K2細胞,、Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞系,，在其表面可穩(wěn)定表達由 于導(dǎo)入刪除1-12位氨基酸的成熟細胞因子而保持跨膜形式的重組人 TNF(Perez等.，Cell 63 :251 -258, 1990),。這種細胞系可用于評價抗TNF 抗體,、抗體片段、或設(shè)計具有Fc區(qū)域或Fc區(qū)域活性的抗TNFoc耙融 合蛋白在ADCC活性中的變化,。

用于體外ADCC活性測定的效應(yīng)細月包可以是人或其它哺乳動物來 源的PBMC(外周血單核細胞）,。可以通過一皮認(rèn)可的方法將PBMC效應(yīng)細 胞從收集的供體血液中新鮮分離出,。其它可以應(yīng)用的單核細胞或巨噬細 胞為流出液體如腹膜滲出液所衍生的那些細胞,。

用于測量細胞免疫功能的體內(nèi)模型也是可用的。例如,，抗CD3抗體 可用于小鼠內(nèi)測量T細胞活化,，因為T細胞活化依賴于抗體Fc域銜接 特異性FcY抗體的方式。體外,，比較了抗CC趨化因子受體4的嵌合體 人IgGl Ab的高巖藻糖和低巖藻糖型式(version)的抗胂瘤活性,，沒有觀 察到它們在體外ADCC活性中的差異(應(yīng)用小鼠效應(yīng)細胞），然而,，低巖藻糖Ab在體內(nèi)顯示更強的效能,。提供了非人的效應(yīng)細胞且小鼠保留內(nèi)源的NK細胞(N雇等.Cancer Res 64:2127-2133, 2004)。因為已證明人 NK細胞上的CD16受體對IgGl Ab的巖藻糖水平有提高的敏感性,，這些 數(shù)據(jù)提示小鼠中起作用的機制不同于人效應(yīng)細胞中所研究的機制,。 一種 可能性為更近發(fā)現(xiàn)的小鼠CD 16-2受體（Mechetma等.Immunogen 54:463-468,2002)。與眾所周知的小鼠CD 16受體相比,，小鼠CD 16-2 的胞外域具有顯著更高的與人CD 16A相同的序列（65%),提示它對其結(jié) 合的IgG的巖藻糖水平可能比小鼠CD 16更敏感,。據(jù)報道鼠巨噬細胞樣 J774細胞中的表達與Niwa等.(2004)所述的表達CD 16-2的鼠巨噬細胞 可導(dǎo)致低巖藻糖Ab有更大抗腫瘤活性的可能性一致。因此,，含人IgGl-型Fc的蛋白質(zhì)結(jié)合Fc受體對鼠效應(yīng)細胞的研究是不可預(yù)言的,。

蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法

生產(chǎn)含有Fc蛋白質(zhì)所涉及的不同方法可影響包括唾液酸的Fc寡糖 的結(jié)構(gòu)。在一個實施方案中,，在先前沒有受到升熱處理(例如56°C, 30 分鐘)的血清例如胎牛血清(FBS)存在下,，培養(yǎng)分泌含有Fc蛋白質(zhì)的宿主 細胞。這可產(chǎn)生含有Fc的蛋白質(zhì),，它不含或含有非常低量的唾液酸,， 這是由于血清中天然存在活性唾液酸酶，它可從這些細胞所分泌的含有 Fc的蛋白質(zhì)上除去唾液酸,。在另一個實施方案中,，在受到升熱處理因此 使唾液酸酶滅活的血清存在下，或者在沒有包含唾液酸酶的血清或其它 培養(yǎng)成份下，培養(yǎng)分泌含有Fc蛋白質(zhì)的細胞,，致使含有Fc蛋白質(zhì)具有 更高水平的唾液酸,，對于應(yīng)用（例如,治療學(xué)適應(yīng)癥）來說這是令人想要的。

在另一個實施方案中,，建立了用于純化和進一步處理含有Fc蛋白 質(zhì)的條件,，可利于優(yōu)化唾液酸含量。例如,，因為唾液酸為酸不穩(wěn)定的,， 延長暴露給低pH環(huán)境，例如隨著從A蛋白層析柱上洗脫或濾過性毒菌 滅活過程期間,，可同時導(dǎo)致唾液酸含量減少,。

宿主細胞的細胞工程學(xué)

如本文所述，用于表達含重組Fc蛋白質(zhì)或單克隆抗體所選擇的宿 主細胞對促成最終組成（包括沒有限于在免疫球蛋白CH2域修飾蛋白質(zhì) 的寡糖部分組成的變體)是重要的,。因此,，本發(fā)明的一個方面涉及選擇適當(dāng)?shù)乃拗骷毎糜诒磉_預(yù)期治療蛋白質(zhì)的細胞生產(chǎn)的用途和/或開發(fā),。 在一個實施方案中,，宿主細胞為天然缺損或缺乏唾液酸轉(zhuǎn)移酶的細 胞。在另一個實施方案中,，宿主細胞為遺傳上修改或處理過的沒有唾液 酸轉(zhuǎn)移酶的細胞,。在進一步的實施方案中,，宿主細胞為經(jīng)選擇衍生的宿 主細胞系,，其表達減少的或不能檢測到的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的水平。在又一 個實施方案中,，宿主細胞為天然缺乏的或為遺傳上修改或處理過的沒有CMP唾液酸合成酶的細i包,，所述酶催化形成CMP唾液酸，其又為唾液 酸轉(zhuǎn)移酶用于轉(zhuǎn)移唾液酸至抗體的唾液酸來源,。在相關(guān)的實施方案中,， 宿主細胞可為天然缺乏的或為遺傳上修改或處理過的沒有丙酮酸合成 酶的細月包，所述酶/人丙酮酸形成唾液酸,。

在另外的實施方案中,，宿主細胞可為天然缺乏的或為遺傳上修改或 處理過的沒有半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的細胞，致使所述細胞中表達的抗體缺乏 半乳糖,。沒有半乳糖,，唾液酸就不能連接。在單獨的實施方案中,，宿主 細胞細胞可為天然過表達的或遺傳上修改為過表達的細胞,，在生產(chǎn)期間 唾液酸酶/人抗體上除去唾液酸。這樣的唾液酸酶可在抗體分泌或分泌至 培養(yǎng)基前在細胞內(nèi)作用于抗體，且作用于已經(jīng)分泌至培養(yǎng)基中的抗體,。 選擇改變了轉(zhuǎn)葡糖基酶的細胞系及其表達改變碳水化合物成分的糖蛋 白方法已經(jīng)有描述（Ripka和Stanley, 1986. Somatic Cell Mol Gen 12:51-62; US2004/0132140),。工程化宿主細力包生產(chǎn)具有改變糖基化型且 導(dǎo)致ADCC提高的抗體的方法，已有教導(dǎo),，例如美國專利6,602,864, 其中宿主細胞包含核酸,所述編碼核酸至少 一個糖蛋白改性的糖基轉(zhuǎn)移 酶,，尤其為P (1,4)-N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶(acetyl glucosamnyltranferase) III (GnTIII)。

如EP1,176,195所教導(dǎo),，通過操作宿主細胞糖基轉(zhuǎn)移酶對宿主細胞 糖基性質(zhì)的基因工程的其它方法包括消除或抑制其活性,，特別地oc -1,6 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8基因產(chǎn)物）。實踐除上述具體實施例外的宿主細胞 工程學(xué)的方法,，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說應(yīng)是顯而易見的,。進一步地，工 程化宿主細胞可以為哺乳動物源細胞或可以選自骨髓瘤,、淋巴瘤,、酵母、 昆蟲或植物細胞,、或它們的任何衍生細胞,、永生化細胞或變異細胞。

在另一個實施方案中,，抑制或消除唾液酸連接所需酶的活性的方法 可以選自基因沉默諸如通過應(yīng)用siRNA,、基因敲除、或加入酶抑制劑,， 諸如通過酶特異性結(jié)合和阻滯其酶活性的細^>內(nèi)Ab或肽的共同表達,，和其它已知的基因工程技術(shù)。在另一個實施方案中,，阻滯唾液酸連接的酶 或除去已連接唾液酸的唾液酸酶的表達或活性的提高方法,，可以選自重組體酶基因轉(zhuǎn)染、提高酶RNA合成的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)染,、或提高酶RN A 穩(wěn)定性的基因修飾,，所有這些導(dǎo)致提高的酶諸如唾液酸酶的活性,致使純 化產(chǎn)物中唾液酸水平更低。在另一個實施方案中,，可以向細胞培養(yǎng)基中 加入特異酶抑制劑,。

抗體

本申請所述的抗體可包括或為任何哺乳動物書f生的，例如^f旦不限于 人,、小鼠,、兔、大鼠,、嚙齒類動物,、靈長類動物或它們的任何組合,，且 包括分離的人、靈長類動物,、嚙齒類動物,、哺乳動物、嵌合體的,、人源 化的和/或CDR嫁接的抗整聯(lián)蛋白抗體,、免疫球蛋白、分解產(chǎn)物和其它 特定的部分和其變體,。本發(fā)明也涉及抗體,，編碼或補充核酸、載體,、宿 主細胞,、組成、制品,、裝置,、轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物,、和制備和應(yīng)用 它們的方法,，如本文所述與本領(lǐng)域已知的共同組合在一起。

本發(fā)明進一步提供細胞,、細胞系,、和細胞培養(yǎng)物，其表達免疫球蛋 白或其片斷,，能使CH2域糖基化,，所述CH2域結(jié)合抗原、細胞因子,、 整聯(lián)蛋白,、抗體,、生長因子,、細胞語系和分化的標(biāo)示物的表面抗原、激 素,、受體或其融合蛋白,、血液蛋白質(zhì)、涉及凝固的蛋白質(zhì),、其任何片斷,、 和任何前述的任何結(jié)構(gòu)或功能類似物。在優(yōu)選的實施方案中,，免疫球蛋 白,、片斷或其衍生物在靶細胞表面結(jié)合抗原,。在尤其優(yōu)選的實施方案中， 輩巴細胞為腫瘤細胞,、腫瘤脈管系統(tǒng)細胞,、或免疫細胞。在具體實施方案 中,，免疫球蛋白,、片斷或其衍生物結(jié)合TNF、整聯(lián)蛋白,、B細胞抗原,、 或組織因子。

在又一個實施方案中,，本發(fā)明的細胞,、細胞系、和細胞培養(yǎng)物可檢 測地表達包含生長因子和激素的融合蛋白,。本發(fā)明期望的生長因子的實 例包括但不限于人生長因子,、血小板衍生的生長因子、表皮生長因子,、 成纖維細胞生長因子,、神經(jīng)生長因子、人絨毛膜促性腺素,、促紅細胞生 成素（erythropoeitm),、血小板生成素、成骨蛋白質(zhì),、轉(zhuǎn)化生長因子,、胰 島素樣生長因子、或胰高血糖素樣肽,、和它們的任何結(jié)構(gòu)或功能的類似 物,。

本發(fā)明的分離抗體包括具有ADCC活性的抗體同型，尤其為人IgGl(例如,，IgGl k和IgG入）,和更少優(yōu)選的IgG2和IgG3,，或在Fc域特異 殘基上含有改變殘基的雜種同型為它們的其它物種相似物的那些抗體。 抗體可為全長的抗體（例如,，IgGl)或可為僅僅包括能夠引出效應(yīng)子功能 (包括ADCC,、補體激活和Clq結(jié)合)的抗原結(jié)合部分和Fc部分或區(qū)域。

此外,，本發(fā)明的細胞,、細胞系、和細月包培養(yǎng)物所產(chǎn)生的免疫球蛋白 片斷可包括但不限于包含F(xiàn)c或其它CH2區(qū)域的結(jié)構(gòu)及其任何結(jié)構(gòu)或功 能類似物,。在一個實施方案中,，免疫球蛋白片斷為二聚體受體域的融合 多肽,。在特定的實施方案中，二聚體受體域的融^多肽為依那西普 (etanercept),。依那西普為重組可溶的TNFa受體分子,，皮下地給藥后與 患者血清中的TNFot結(jié)合，使之在生物學(xué)上失去活性,。依那西普為二聚 體融合蛋白,，由與人IgGl的Fc部分連接的人75千道爾頓(p75)腫瘤壞 死因子受體(TNFR)的細胞外配體結(jié)合部分組成。依那西普的Fc成分包 含CH2域,、CH3域和鉸鏈區(qū),，但不含IgGl的CH1域。

應(yīng)用本發(fā)明細胞系易于制備的其它產(chǎn)物包括目前由其它類型的動 物細胞系所制備的具有能夠被糖基化的CH2的治療或預(yù)防性蛋白質(zhì),。特 別優(yōu)選的為治療的,、糖基化的、含CH2區(qū)域的與細胞表面的靶抗原結(jié)合 的蛋白質(zhì),，其細胞類型預(yù)期可由體內(nèi)失能或消除,。許多這樣的治療性抗 體被設(shè)計為包含人IgGl，尤其包含人CH1,、 CH2和CH3域的IgGl重鏈,。

英利昔單抗(Infliximab),目前以REMICADE⑧銷售。英利昔單抗為 嵌合體的IgGlK單克隆抗體,，具有大約149,100道爾頓的分子量,。它包 含人恒定區(qū)和鼠可變區(qū)。英利昔單抗特異性結(jié)合人腫瘤壞死因子oc (TNF(oc)),其結(jié)合常數(shù)為101GM-1,。英利昔單抗通過高親和性結(jié)合可溶 性和跨膜形式的TNF(oc)并抑制TNF(a)與其受體的結(jié)合,，中和TNF(a) 的生物活性。表達與英利昔單抗結(jié)合的跨膜TNF(cx)的細胞可在體外或 體內(nèi)溶解,。英利昔單抗適用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,、克羅恩氏病和僵直 性(alkylosing)脊推炎。英利昔單抗以靜脈輸注給予3至5 mg/kg的劑量 給藥,，隨后根據(jù)要治療的疾病在第2,、 6和/或8周且以每8周的間期給 予另外的類似劑量。

達克珠單抗（以ZENAPAX⑧銷售）為通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的免疫 抑制的,、人源化的IgGl單克隆抗體,，它與活化淋巴細胞表面表達的人高 親和性白細胞介素2(IL-2)受體的cc亞單位(p55 cx 、 CD25,、或Tac亞單位）特異性結(jié)合。達克珠單抗為互補決定區(qū)(CDR)嫁接的d,、鼠-人嵌合抗體,。

人序列來自人IgGl恒定域和Eu骨髓瘤抗體的可變構(gòu)架區(qū),。鼠序列來自 鼠抗Tac抗體的CDR。達克珠單抗適用于預(yù)防接受腎移植患者的急性器 官排斥并通常用作免疫抑制方案（包括環(huán)孢菌素和皮質(zhì)甾類）的一部分,。

巴利昔單抗（以SIMULECT⑧銷售）為通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的嵌合 (鼠/人)單克隆抗體,，其充當(dāng)免疫抑制劑，特異性結(jié)合并阻滯于活化T淋 巴細胞表面上的白細胞介素2受體（oc)-鏈(IL-2R(oc),也稱作CD25抗 原）,?；诎被嵝蛄校鞍踪|(zhì)的計算分子量為144千道爾頓,。它為糖蛋 白,，獲自遺傳工程所建立的小鼠骨髓瘤細胞系的發(fā)酵，以表達編碼選擇 性結(jié)合IL-2R(a)的RFT5抗體的包含人重和輕鏈恒定區(qū)基因（IgGl)和鼠 重和輕鏈可變區(qū)基因的質(zhì)粒,。巴利昔單抗適用于預(yù)防接受腎移植患者的 急性器官排斥,，用作免疫抑制方案（包括環(huán)孢菌素和皮質(zhì)甾類）的一部分。

阿達木單抗（以HUMIRA?銷售）為人腫瘤壞死因子(TNF)特異的重 組體人IgGl單克隆抗體,。應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)制造阿達木單抗,，導(dǎo)致抗 體具有人衍生的重和輕鏈可變區(qū)和人IgGl k恒定區(qū)。HUMIRA⑧適用于 對一和多種DMARD不充分反應(yīng)的具有中等至嚴(yán)重的活動風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎的成年患者,，以減少體征和癥狀以及抑制結(jié)構(gòu)'性損傷的進行,。 HUMIRA⑧可單獨或與MTX或其它的DMARD結(jié)合應(yīng)用。

利妥昔單抗（以RITUXAN⑧銷售）為遺傳工程嵌合的鼠/人單克隆抗 體,，直接對抗正常和惡性B淋巴細胞表面上發(fā)現(xiàn)的CD20抗原,。抗體為 IgGl k免疫球蛋白,，包含鼠輕和重鏈可變區(qū)序列和人恒定區(qū)序列,。利妥 昔單抗對CD20抗原的結(jié)合親和力大約為8.0nM。利妥昔單抗適用于治 療低級別或濾泡的,、CD20 P日性,、B細胞非何杰金淋巴瘤的復(fù)發(fā)或難治 性患者。RITUXAN?以375 mg/m 2 IV輸注給藥,，每周一次應(yīng)用4或8 次劑量,。

曲妥珠單抗（以HERCEPTIN⑧銷售）為重組DNA衍生的人源化單克 隆抗體，其在基于細胞測定(Kd二5nM)中對人表皮生長因子受體2蛋白質(zhì) HER2的胞外域具有高親和力的選擇性結(jié)合,。該抗體為IgG 1 k,包含 人構(gòu)架區(qū),，具有與HER2結(jié)合的鼠抗體（4D5)的互補決定區(qū)。 HERCEPTIN(赫賽?。┛蛇m用于單種藥物治療法,，用于治療轉(zhuǎn)移乳l^癌 (這種腫瘤過度表達HER2蛋白質(zhì))且對其轉(zhuǎn)移性疾病已接受一種或多種 化學(xué)療法方案的患者。HERCEPTIN⑧與紫杉醇組合適用于治療轉(zhuǎn)移乳腺癌（這種腫瘤過度表達HER2蛋白質(zhì)）和對其轉(zhuǎn)移性疾病沒有接受化學(xué)療 法方案的患者,。推薦劑量為90分鐘輸注給予起始負荷劑量的4 mg/kg 曲妥珠單抗,，如果起始負荷劑量耐受良好可30分鐘輸注給予每周維持 劑量的2 mg/kg曲妥珠單抗,。

阿侖珠單抗（以CAMPATH⑧銷售）為重組DNA衍生的人源化單克隆 抗體(Campath-lH)，直接對抗21-28 kD細胞表面糖蛋白CD52,。阿侖珠 單抗結(jié)合CD52,為非調(diào)節(jié)的抗原,，位于基本上所有B和T淋巴細胞， 大部分單核細胞,，巨嗟細胞和NK細胞,，粒細胞亞群，和雄性生殖系統(tǒng) 組織的表面,。Campath-1H抗體為IgGlK ,具有人可變構(gòu)架區(qū)和恒定區(qū),， 和鼠（大鼠)單克隆抗體(Campath-lG)的互補決定區(qū)。Campath適用于治療 B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)的患者,，該患者已經(jīng)用烷化劑治療且 經(jīng)歷氟達拉濱治療失敗,。Campath效果測定是基于整體響應(yīng)率。最初給 予3 mg的Campath,每日2小時內(nèi)IV輸注給藥,；一旦耐受,此每日劑量 應(yīng)升至10mg并連續(xù)給藥直至耐受,。 一旦耐受了這種劑量水平，可開始 以30mgCampath的維持劑量,，每周三次給藥,，最高可給予12周。在大 多數(shù)患者,，升至30mg可在3-7天內(nèi)實現(xiàn),。

奧馬珠單抗（以XOLAIR⑧銷售）為重組體人源化的IgGl( k )單克隆抗 體，其與人免疫球蛋白E(IgE)選擇性結(jié)合,。奧馬珠單抗抑制IgE與肥大 細胞和嗜堿細胞表面上的高親和性IgE受體(Fc(s)RI)的結(jié)合,。在攜帶 (Fc(s)RI)細胞上表面結(jié)合IgE的減少限制了變應(yīng)性應(yīng)答介質(zhì)的釋放程 度。用奧馬珠單抗治療也減少了特應(yīng)性患者嗜堿細胞上Fc( s )RI受體的 數(shù)目,。奧馬珠單抗適用于中等至嚴(yán)重持續(xù)哮喘的成人和青少年(12歲和癥狀為吸入皮;甾類;能充;控制的,。以15〉0」375^mg的劑量每2或: 周SC給予奧馬珠單抗。

依法珠單抗(RAPTIV A?)為與人CD11 a結(jié)合的免疫抑制的重組人源 化的IgGl k同型單克隆抗體,。依法珠單抗結(jié)合所有白細胞上表達的 CD11 a(白細胞功能抗原-1 (LFA-1)的（a )亞單位）,并減少細胞表面CDlla 的表達,。依法珠單抗抑制LFA-1與胞間粘附分子-l(ICAM-l)的結(jié)合，因 而抑制白細月包與其它類型細^9包的粘附,。LFA-1和ICAM-1之間的相互作 用促成多種進程的開始和維持,，所述進程包括T淋巴細胞激活、T淋巴 細胞與內(nèi)皮細胞的粘附,、和T淋巴細胞遷移至炎癥包括牛皮痺皮膚的位置,。淋巴細胞活化和運輸至皮膚在慢性斑塊狀銀屑病的病理生理學(xué)中擔(dān) 任作用。牛皮褲皮膚中，ICAM-1細胞表面的表達在內(nèi)皮和角化細胞是向上調(diào)節(jié)的,。CDlla也在B淋巴細胞,、單核細胞,、中性白細胞,、天然殺 傷細胞和其它白細胞的表面上表達。因此,，依法珠單抗對激活,、粘附、 遷移和除了 T淋巴細胞的細胞數(shù)目存在潛在性影響,。RAPTIVA⑧的推薦 劑量為單獨0.7 mg/kg SC調(diào)節(jié)劑量(conditioning dose),隨后1 mg/kg的 每周SC劑量(最大單次劑量總數(shù)不超過200 mg),。

在另 一 個實施方案中,本發(fā)明的細胞系是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的或另外工程化 表達非免疫球蛋白衍生的多肽的細胞系，但是所述多肽落在含有Fc蛋 白質(zhì)定義內(nèi),。

本發(fā)明編碼核酸的抗體和蛋白質(zhì)可用本領(lǐng)域眾所周知的幾種方法 獲得,。在一個方面，通過用本發(fā)明肽免疫小鼠制備的雜交瘤可方便地獲 得抗體,?？贵w因此能得自所用的本領(lǐng)域眾所周知的任何雜交瘤技術(shù)，參見i"列^t口,，Ausubel,等纟扁4辱,，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook,等.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版,，Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow和Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989》Colligan,等編輯,，Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY G"4-2001); Colligan等.，Current Protocols in Protem Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001),在此將各自的全文引 入,，作為參考,。

在抗體的靼結(jié)合部分（一般為抗體的可變重和/或可變輕區(qū)域)衍生 的另一個適宜方法中，這些部分選自已建立的結(jié)合區(qū)域文庫,，例如噬菌 體文庫,。通過插入包含感興趣序列的任意寡核苷酸文庫或多聚核苷酸文 庫，例如來自免疫動物或人的B細胞,可建立噬菌體文庫（Smith, G.P. 1985. Science 228: 1315-1317),?？贵w噬菌體文庫在一個噬菌體中包含重 (H)和輕(L)鏈可變區(qū)對，可表達單鏈Fv片斷或Fab片斷(Hoogenboom,等. 2000, Immunol. Today 21(8) 371-8),?？衫檬删Ｎ膸斓亩鄻有砸栽黾?和/或改變文庫單克隆抗體的免疫特異性，以生產(chǎn)另外預(yù)期的人單克隆抗 體并隨之鑒定,。例如可將編碼重(H)鏈和輕(L)鏈的免疫球蛋白分子的基 因隨機地混合(混洗)以在裝配的免疫球蛋白分子中建立新的HL對,。

此外，可在免疫球蛋白多肽可變區(qū)的互補性決定區(qū)（CDR)將編碼H和L鏈的兩者或之一的基因誘變處理，隨后篩選預(yù)期的親和力及中和能 力,。通過選擇一或多個人構(gòu)架序列并引入人抗體譜衍生或變體設(shè)計的CDR盒(cassette)集合,，也可合成地建立抗體文庫(Kretzschmar and von Ruden 2000, Current Opinion in Biotechnology, 13:598-602)。多樣性的位 置不限于CDR,也可包括可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)段或可包括與抗體不同的可變 區(qū),，例如肽類,。

可包括與抗體不同的可變區(qū)的耙結(jié)合成分的其它文庫為核糖體展 示、酵母展示,、和細菌展示,。核糖體展示為在保持蛋白質(zhì)與RNA連接 時將mRNA翻i,成同源蛋白質(zhì)的方法。編碼核酸的序列通過RT-PCR恢 復(fù)(Mattheakis, L.C.等.1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,卯22),。酵母 展示基于膜相關(guān)的oc凝集素酵母粘著受體(agal和aga2,交配型系統(tǒng)的 一部分）的融合蛋白構(gòu)建（Broder,等.1997. Nature Biotechnology, 15:553-7),。細菌展示為基于與細胞膜或細胞壁相關(guān)的輸出細菌蛋白質(zhì)的 革巴向鬲蟲合(Chen and Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503)。

與雜交瘤技術(shù)學(xué)比較,，噬菌體和其它抗體展示的方法提供了體外抗 抗原靶的選擇性操作的機會,，且不受到宿主對抗原可能影響的限制，或 者反之亦然,。

宿主細月包

本文所述的宿主細胞包括能夠產(chǎn)生特異性抗體宿主細胞,，所述抗體 的寡糖容量中具有確定的唾液酸含量。

不像大多數(shù)從連續(xù)基因組DNA序列轉(zhuǎn)錄的基因,，抗體基因是由種 系中廣泛分離的基因節(jié)段所裝配的,。特別地，通過重組編碼抗體可變 (V),、多變(D)和連接(J)/恒定(C)區(qū)的三個基因組段,，形成重鏈基因。通 過連接兩個基因節(jié)段,，其中一個編碼V區(qū)和另一個編碼J/C區(qū),，形成功 能輕鏈基因。重鏈和k輕鏈基因座均含有多個V基因片段(估計在100 ~ 1000之間變化）,，估計充分?jǐn)U展可達1000 kb,。作為對比，入基因座是非 常小的,，已經(jīng)顯示在小鼠染色體16上伸展大約為300 kb,。它由兩個可 變基因區(qū)段和四個連接/恒定(J/C)區(qū)基因段組成。功能基因的形成要求V 和J/C成分之間重組,。

在天然產(chǎn)生抗體的B細胞中,，對重和k輕鏈基因兩者重排的轉(zhuǎn)錄控 制依賴于V區(qū)上游組織特異性啟動子的活性和位于J-C內(nèi)含子的組織特異性增強子的活性。這些成分協(xié)同地作用,。并且,，在K輕鏈基因座中已 經(jīng)鑒定了第二種B細胞特異性增強子,。這種另外的增強子位于Ck的下游9kb處,。因此，使永生抗體表達基因的雜交瘤方法依賴于母體B細胞 譜系的內(nèi)源啟動子和增強子序列,。替代選擇地，在包含編碼內(nèi)源DNA 的本發(fā)明抗體的內(nèi)源宿主細胞中通過啟動（通過操作），可以在宿主細胞 中表達本發(fā)明的核酸,。這樣的方法是本領(lǐng)域眾所周知的,，例如美國專利 號5,580,734、 5,641,670,、 5,733,746、和5,733,761中所述的,，在此將這 些專利全文引入，作為參考。

將抗體基因組DNA克隆至人工載體為建立能夠表達抗體的宿主細 胞的另一種方法,。然而，強啟動子后單克隆抗體的表達增加了鑒別高產(chǎn) 細胞系和獲得高產(chǎn)率單克隆抗體的機會,。應(yīng)用例如本領(lǐng)域眾所周知的重 組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染的組合方法，可在宿主細胞轉(zhuǎn)染瘤中生產(chǎn)本發(fā) 明的抗體(例如,，Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。

在多種不同宿主細胞中的克隆和多肽表達系統(tǒng)是眾所周知的,。適用 的宿主細胞包括細菌,、哺乳動物細胞,、植物細胞,、酵母和桿狀病毒系統(tǒng) 以及轉(zhuǎn)基因植物和動物。本領(lǐng)域中可用的表達完整異種多肽糖基化蛋白 的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,、HeLa纟田胞,、倉鼠嬰腎 細胞(BHK)、 NSO小鼠黑色素瘤細l包和衍生的細胞系（例如SP2/0,、 YB2/0(ATC CRL-1662)大鼠骨髓瘤細胞),、人胚腎細胞(HEK)、人胚視網(wǎng) 膜細胞PerC.6細胞,、hep G2細胞BSC-l(例如ATCC CRL-26)和可用的 許多其它細月包系，例如來自美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)收集所Manassas, Va (www.atcc.org)的細l包系,。通常優(yōu)選的細菌宿主為大腸桿菌（E. coli),。

哺乳動物細胞例如CHO細胞、骨髓瘤細胞,、HEK293細胞,、BHK 細胞(BHK21、 ATCCCRL-IO),、小鼠Ltk細胞,、和NIH3T3細胞，已常 用于異源基因的穩(wěn)定表達,。細胞系如Cos(COS-l ATCC CRL 1650; COS-7: ATCC CRL-1651)和HEK293是常規(guī)用于重組蛋白質(zhì)瞬時表達的,。

用于表達本發(fā)明重組抗體優(yōu)選的哺乳動物宿主細胞包括骨髓瘤細 月包例如Sp2/0、 YB2/0(ATC CRL-1662),、 NSO,、和P3X63.Ag8.653(例如 SP2/0-Agl4),這是因為它們的高速表達,。特別地，至于應(yīng)用NSO骨髓 瘤細胞,，另一個優(yōu)選的表達系統(tǒng)為WO 87/04462,、 WO 89/01036,、和EP 338,841中公開的GS基因表達系統(tǒng),。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達載體 引入哺乳動物宿主細胞時,，通過將宿主細胞培養(yǎng)足夠的時期以使抗體在宿主細胞中表達來生產(chǎn)抗體,，更優(yōu)選地,，抗體分泌至宿主細胞生長的培 養(yǎng)基中,。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化方法,，可從培養(yǎng)基中回收抗體,。

CH0-K1和DHFR-CHO細胞DG44和DUK-Bll(G. Urlaub, L. A. Chasm, 1980. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77， 4216匿4220)被用于高水平 的蛋白質(zhì)生產(chǎn),，因為通過應(yīng)用例如藥物曱氨喋呤(MTX)摻入可選擇的擴 增的標(biāo)記DHFR,，能夠進行感興趣的基因擴增（RJ. Kaufman, 1990. Methods Enzymol. 185:537-566)。 DHFRXHO細胞可成功地用于高水平 生產(chǎn)重組體mAb。 DHFR-CHO可以以80-110 mg 106細胞"天-1的速度或 大于200 mg 106纟田胞"天"的速度產(chǎn)生抗MCP-1抗體,。已用多種啟動子 以獲得在這些CHO細胞中H-和L-鏈的表達,，例如b-肌動蛋白啟動子、 人CMVMIE啟動子,、腺病毒(Ad virus)主要晚期啟動子(MLP),、 RSV啟 動子、和鼠白血病病毒LTR,。在文獻中描述了許多表達mAb的載體,， 其中兩個Ig鏈被兩個不同的具有獨立可選擇/擴增標(biāo)記的質(zhì)粒攜帶。載 體含有一個抗體鏈例如與DHFR標(biāo)記連接H-鏈,，且與Ne(/標(biāo)記連接L-鏈表達盒或者反過來也一樣,，此載體在旋轉(zhuǎn)燒瓶中可用于獲得高達180 mg的人源化mAb L"7天人用于起始選擇和隨后擴增的方法可以是各 式各樣的且是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。 一般而言,，應(yīng)用下述步驟可 獲得高水平的mAb表達:起始選擇和隨后擴增的候選的克隆,，共選擇(例 如在H-鏈和L-鏈兩種表達載體攜帶DHFR表達單位的情形中）和擴增， 應(yīng)用不同擴增標(biāo)記的共擴增,，和起始選擇和隨后擴增的大量培養(yǎng),，隨后 通過稀釋克隆法鑒定各個高表達的克隆。因為整合位點可以影響H-鏈和 L-鏈表達和全部mAb表達的效率,，已建立了其中兩個Ig-鏈表達單位串 聯(lián)在一起的單載體,。這些載體也攜帶顯性可選標(biāo)記諸如Ne(/和DHFR 表達盒。至于綜述參見Ganguly, S.和A. Shatzman. Expression Systems, mammalian cells IN: Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation: Biocatalysis, and Bioseparation. 1999,， John Wiley & Sons,Inc.,。

Cockett等（1990. Bio/Technology 8, 662-667)開發(fā)了在CHO細胞中 高水平表達異源基因的GS系統(tǒng)。將包含cDNA(在hCMV啟動子的轉(zhuǎn)錄 控制下）和GS小基因（在SV40后期啟動子控制下）的表達載體轉(zhuǎn)染至 CHO-K1細月包(用20 mM ~ 500 mM MSX選擇后）,，可用于產(chǎn)生表達本發(fā) 明抗體的克隆,，其產(chǎn)率比得上DHFR-CHO系統(tǒng)中的產(chǎn)率。結(jié)合歐洲專 利號0 216 846,、 0256 055,、和0 323 997和歐洲專利申"i青號89303964.4,整體或部分地討論了 GS系統(tǒng)。

當(dāng)以一般術(shù)語描述本發(fā)明后,，在下列實施例中進一步公開了本發(fā)明 的實施方案,。

實施例l:唾液酸不同水平的抗體種類基于凝集素的分離

與MAA(懷槐凝集素)或WGA(麥胚凝集素)偶聯(lián)的瓊脂糖小球購自 Vector Labs或EY Labs。測試抗體Abl為完全人類單克隆抗體,可結(jié)合人 TNF,。將于含20 mM CaCl2和20 mM MgCl2的20 mM Tris-HCl緩沖劑 (pH 7.0)中的Abl(~ 1-10 mg),在MAA-瓊脂糖或WGA-瓊脂糖柱上分級 分離,。與MAA-瓊脂糖柱結(jié)合的Abl用0.5%乙酸洗脫，用1M Tris-HCl (pH7.0)中和,，然后將緩沖劑換為PBS。這種物質(zhì)稱作Abl MAAB。

在將Abl抗體樣品裝載至WGA-瓊脂糖柱后,，收集非結(jié)合(T,經(jīng)過） 部分,，并將緩沖劑換為PBS。這種物質(zhì)稱作Abl WGAT,。如上所述用相 同的緩沖劑清洗含結(jié)合Abl的柱,，當(dāng)在280 nm測量OD監(jiān)測時，收集 lml部分的任何洗脫的抗體(代表弱結(jié)合(R,延滯)物質(zhì)）,。將洗脫的物質(zhì)的 緩沖劑換為PBS,，稱作Abl WGA-R。最后,，洗過后還與柱結(jié)合的物質(zhì) 用200 mM GlcNAc溶液洗脫,，并將樣品緩沖劑換為PBS。這種物質(zhì)稱 作Abl WGAB,。 HPLC和質(zhì)譜法分析顯示各子批的Abl實際上改變了其 唾液酸的含量(參見表1),范圍從Abl MAAB的高43%至Abl WGAT 的低29%,。將另 一批未改性的Ab 1-29直接經(jīng)過固定的麥胚凝集素(WGA) 凝集素。測定流過的部分和弱結(jié)合部分,，分別含有29%和41%唾液酸化 聚糖,，并稱作Abl-WGA-29和Abl-WGA-41。

另 一個抗TNF Ab為Ab2,其含有大約5%Fc唾液酸化,，在WGA柱 分級分離前首先用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理以制備完全半乳糖基化的物質(zhì),， 形成大量的Ab2-GT-WGA-5和少量的Ab2-GT-WGA-67。 Ab2識別的抗 原與Abl識別的抗原相同,，Ab2識別的抗個體基因型（抗Id)抗體稱作抗 Id2,。

實施例2:半乳糖基化和唾液酸化抗體的酶修飾

為經(jīng)酶方法使純化的抗體樣品半乳糖基化，向抗體樣品中加入來自 Sigma Chemical Co.(St. Loms, MO)的牛P -1,4陽半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（(3 1,4GT) 和UDP-Gal,。重組體大鼠肝oc畫2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶（oc 2,3ST),、重組體cc陽1,3陽-Sia來自Calbiochem (San Diego, CA)。 PNGase F來自New England Biolabs (Beverly, MA)或來自Prozyme (San Leandro, CA)或來自Selectin Biosciences (Pleasant Hill, CA),。 （3 -半 乳糖苷酶和肺炎雙球菌（Z^/?/ococc^ ;?wewwomae)的p-氨基葡糖苷酶獲 自ProZyme或Selectm BioSciences,。牛腎的P -半乳糖苷酶和所有其它的 酶獲自ProZyme或獲自Selectin Biosciences。 NAP-5和HiTrap蛋白A 柱獲自Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ),。所有其它的試劑為分析等級,。

制備Abl的酶去糖基化形式(稱作Gno),作為缺乏Fc免疫效應(yīng)子功 能的對照抗體。這種變體的制備方法,，包括取于100 mMMES緩沖液(pH 7.0)中的Abl(~ 10 mg ,1.0 mL緩沖液中）并用1000 U PNGase F在37°C 處理24小時,。加入另一等分部分的酶并再繼續(xù)孵育24小時。將去糖基 化Abl用HiTrap蛋白A柱純化,，并用pH 7.0 PBS配制,。通過 MALDI-TOF-MS賦予Gno糖形的特征,，以證實去糖基化。

除實驗室所操作的Ab制品之外,，也比較了唾液酸含量天然不同的 Ab子批,，此處是指'天然變體'。將從初始批物質(zhì)的緩沖劑換為PBS后,， 未改性的抗體稱作Abl PBS,。人IgGl單克隆Ab, Abl和Ab3，其中此 對成員的唾液酸化程度不同,，顯然是由于用于制備它們的不同產(chǎn)生過程 (但是用同樣的宿主細胞型生產(chǎn)）,。Abl變體,Abl-20和Ab 1-29,分別含有 20%和29。/,。唾液酸化聚糖,；Ab5變體,Ab5-20和Ab5-26,分別含有0%和 26%唾液酸化聚糖。另外,，每對成員具有同樣的氨基酸序列,、同樣水平 的Fc巖藻糖基化和二等分GlcNAc含量(MALDI-TOF質(zhì)譜法分析）、和 同樣低水平的Ab聚集物(通過SEC-HPLC分析<1%),。

表1中概述了用于各種生物測定的Ab和含有Fc的蛋白質(zhì)制品及衍 生它們的方式,。

32表1.本文所用測試的含有Fc蛋白質(zhì)制品的總目錄

母體 特異變體 %唾液酸化 說明

抗體

AM — 一 抗TNF人IgGl抗體

Abl未改性的， 29 初始組成,天然唾液酸變體

Abl-29

Abl Gno N.A. 酶去糖基化的

AblPBS 29 未改性的,，緩沖劑交換成PBS

Abl-20 20 天然唾液酸變體

AblMAAB 43 與MAA凝集素柱結(jié)合

AblWGAB 32 與WGA凝集素柱結(jié)合

AblWGAR 40 -波WGA省是集素柱延滯的

AblWGAT 29 經(jīng)過WGA凝集素柱的

Abl畫WGAR畫41 41 被WGA凝集素柱延滯的

Abl陽WGAT-29 29 經(jīng)過WGA凝集素柱的

Abl G2 0 酶改性成完全半乳糖基化

Abl G2S2(hi) 95 酶改性成G2S2

Abl G2S2(b) 33 失去大多數(shù)唾液酸的G2S2

Ab2 - — 抗TNF人IgGl抗體

未改性的Ab2 5% 未改性的,用于Fc y ri結(jié)合,，圖6

Ab2 G2 0% 改性的,用于小鼠PK研究，圖8

Ab2 G2S2 ~ 90 % 改性的,用于小鼠PK研究,，圖8

Ab2 AlaAla 不相關(guān)的 對FcyR缺乏親和性的突變型抗 TNF

Ab2 GT-WGAT 5 經(jīng)過WGA湊是集素柱的

Ab2 GT-WGAR 67 半享L糖基化且與WGA凝集素柱結(jié)合

Ab3 - 一 對細胞因子亞單位的特異

Ab3(lo) 2 天然唾液酸變體

Ab3(hi) 42 天然唾液酸變體

Ab4 Ab4 — 小鼠IgGl(對Fc y RI缺乏親和性）

Ab5 Ab5 結(jié)合異二聚體細胞表面受體

33<table>table see original document page 34</column></row> <table>所有測試樣品包含人IgGl鉸鏈,、CH2、和CH3域,。Abl,、 Ab2、 Ab3,、和Ab5為單克隆IgG Ab,具有人IgGl和k恒定區(qū),。Abl為對人 TNF特異的完全人Ab, Ab2為對人TNF特異的鼠/人嵌合體Ab。 Ab3 為對異二聚體促炎細胞因子的亞單位之一特異性的完全人Ab,。所有四 個Ab均在轉(zhuǎn)染Sp2/0的小鼠骨髓瘤細胞中表達,。Ab5為直接對抗異二 聚體細胞表面受體亞單位的全人抗體。FcPl為二聚體融合蛋白,，其包含 人的人IgGl鉸鏈,、CH2和CH3域。

G2糖形的制備方法,，包括在37,。C使于100 mM MES緩沖液(pH 7.0) 中的IgG樣品（?10 mg , 1.0 mL緩沖液中）受到50毫單位的P 1,4GT,、 5 m mol的UDP-Gal 、和5 m mol的MnC12的24小時處理,。加入另 一等 分部分的酶和UDP-Gal,并將混合物在37,。C再孵育24小時。將去半乳 糖化的IgG樣品用HiTmp蛋白A柱純化,。通過PNGaseF釋放寡糖， 并如下所述通過MALDI-TOF-MS和HPLC f武予特征,。

G2S2糖形的制備方法,，包括根據(jù)廠商建議的方案，應(yīng)用NAP-5柱 使IgG樣品進入100 mM MES緩沖液(pH 7.0)中（~ 10 mg , 1.0 mL緩沖液 中）,。向這種溶液中加入各自50毫單位的Pl,4GT和a2,3ST以及各自5 jumol的UDP-Gal,、 CMP-Sm (NANA同分異構(gòu)體)和MnCl2。將混合物 在37,。C孵育,。24小時后，隨同核苷酸糖一起加入另一等分部分的酶,， 并將混合物在37,。C再孵育24小時。如上所述,，將IgG樣品的G2S2糖 形純化,。至于一種特定Abl G2S2批，Abl G2S2(lo),，初始連接的唾液酸 在隨后的儲存期間失去,，或許由于污染了唾液酸酶。分析表明AM g2s2(lo)中僅有300/,。Fc寡糖包含唾液酸,而Abl g2s2(hi)中~ 95%寡糖包 含唾液酸,。

通過多種方法分析了 Ab制品的聚糖結(jié)構(gòu)。為了進行完整IgGAb的 MALDI-TOF-MS分析,，使IgG樣品進入pH 7.0的10 mM Tns-HCl緩沖 液中并調(diào)節(jié)濃度至?1 mg/mL緩沖液,。將大約2 ju 1 IgG溶液與2 jli 1基質(zhì)溶液(基質(zhì)溶液的制備方法，包括將10 mg芥子酸(smnapinic acid) 溶入1.0 ml的含0.1%三氟乙酸的50%乙腈水溶液中）混合,，將2 ml的 這種溶液裝載至草巴標(biāo)并4吏之風(fēng)干,。應(yīng)用Applied BioSystems的Voyager DE儀器(Foster City, CA),獲得MALDI-TOF-MS。

為進行釋出Fc聚糖的MALDI-TOF-MS分析,，在體外糖基化反應(yīng)之 前和之后,，在37。C將IgG樣品（~ 50 ju g)在pH 7.0的10 mM Tris-HCl buffer (50 ju 1)緩沖液中用PNGase F消化4小時,。通過用50%乙酸（~5 |u l)將反應(yīng)混合液酸化而終止消化,，然后如先前所述通過陽離子交換樹 脂柱(Papac等.,1996; Papac等.,，1998; Raju等.，2000),。如同別處所述 (Papac等.，1996; Papac等.,，1998;Raju等.,，2000)應(yīng)用 Applied BioSystems的Voyager DE儀器(Foster City, CA),通過陽和陰離子方式 的MALDI-TOF-MS，分析包含酸性和中性寡糖的混合物這些樣品,。

在37,。C通過在pH 7.0的10 mM Tris-HCl buffer ( ~ 50 |u 1)緩沖液 中用PNGase F消化IgG樣品（~ 50 ju g)4-8小時，進行Fc聚糖的HPLC 分析,。如(參見Anumula KR, Anal Biochem. 2000 Jul 15;283(1):17陽26)所 述,，將釋出的寡糖用鄰氨基苯曱酸(2-氨基苯曱酸)進行衍生化。簡言之,， 首先制備4%醋酸鈉3H20(w/v)和2%硼酸(w/v)的曱醇溶液,。然后通過 將~ 30 mg鄰氨基苯甲酸(Aldrich)和~ 20 mg氰基硼氫化鈉(Aldrich)溶解 在1.0 ml曱醇-醋酸-硼酸-鈉（methanol-sodium acetate-borate)溶液中，得 到新鮮配制的衍生化試劑,。在1.6ml聚丙烯螺旋帽的"O"環(huán)冷凍小瓶 (Sigma)中,，將lgG衍生化寡糖(〈3 nmol , 20-50 ju 1水溶液)與0.1 ml 鄰氨基苯曱酸(AA)試劑溶液混合并蓋緊瓶蓋,。將小瓶用80,。C的烘箱或加 熱塊(Reacti-Therm, Pierce)加熱1-2小時。將小瓶冷卻至室溫后,，用水稀 釋樣品使體積至~ 0.5 ml,。通過應(yīng)用NAP-5柱將書f生化寡糖純化,。

實施例3:與低親和性細胞FC受體的結(jié)合

效應(yīng)細胞上的幾種類型的Fc受體中，F(xiàn)cy型n和m被認(rèn)為是低或 中等親和性受體,。 一般地,，單體的結(jié)合可能親和性太低而不能檢測到或 為非常低的水平,。例如,，單體IgG與y型IIA的結(jié)合是很難測量的。這 些受體起作用與免疫復(fù)合物結(jié)合,，這是由于它們更親合的多效價的本質(zhì) 結(jié)合,，或許是由于復(fù)合物減慢的速率,。

人K562細胞，它表達作為唯一的Fc y受體的Fc yRIIA,用于兩種類型的結(jié)合測定,，以測試Fc聚糖中酸唾液含量的改變是否影響與這種低親和性人Fc y受體的結(jié)合,。為了獲得與Fc y RIIA(其對單體IgG具有 低親和性）有足夠親合的結(jié)合，將抗TNF的測試Ab與同型三聚體 (homotrimeric)TNF以2:1摩爾比混合,，制備免疫復(fù)合物,，該比率顯示^叉 產(chǎn)生痕量游離的Ab或游離的TNF。對免疫復(fù)合物的依賴進行了舉例說 明,，放射標(biāo)記的Ab2單獨在濃度高達1 ug/ml時不能檢測到其與K562 細胞的結(jié)合,，但是Ab2:TNF復(fù)合物在0.02 ug/m時顯示顯著的結(jié)合(未展 示數(shù)據(jù)）。

竟?fàn)幗Y(jié)合形式.制備兩組IgG免疫復(fù)合物,，標(biāo)記的復(fù)合物包含人 IgGl抗體，所述抗體對抗V區(qū)特異性非人類的Ab和Ab5的復(fù)合具有不 相關(guān)的特異性,。為了建立標(biāo)記的復(fù)合物,，如先前所述(Kmght等.,，1993) 應(yīng)用IODO-GEN試劑,，將嵌合體單克隆Ab(攜帶的倉鼠V區(qū)以及人IgGl 和輕鏈k恒定區(qū))碘化。然后將倉鼠-人嵌合體V區(qū)個體基因型的特異性 大鼠IgG2a單克隆Ab以1:1摩爾比在PBS中混合30分鐘,，以形成放射 標(biāo)記的免疫復(fù)合物,。大鼠抗Id顯示不能促成與FcyRIIA的直接結(jié)合,， 當(dāng)制備的復(fù)合物具有去糖基化的倉鼠-人嵌合體時，發(fā)生少的結(jié)合;然而 復(fù)合物具有未改性嵌合體的Ab時顯示高水平的結(jié)合(未展示數(shù)據(jù)),。此 外,，用于制備單獨免疫復(fù)合物的試劑之間沒有檢測到交叉反應(yīng)性，交叉 反應(yīng)性可表明一種免疫復(fù)合物可能結(jié)合另一種免疫復(fù)合物（未展示數(shù) 據(jù)）,。

為了測試復(fù)合物,，室溫下將唾液酸變體的Abl與人TNF同型三聚 體以2:1摩爾比(通過光散射分析顯示，產(chǎn)生非常少的非結(jié)合的Ab和非 結(jié)合的TNF)在PBS中混合30分鐘,。在一組實馬全中,，將具有百分比20 和29的唾液酸的Abl天然變體的復(fù)合物彼此進行比較。在第二組實驗 中,，將Abl-29:TNF復(fù)合物與凝集素柱增強的制品Abl-43:TNF復(fù)合物進 行比較,。在兩種情況下對照復(fù)合物為Abl-Gno:TNF,其中抗體被酶除去 聚糖。

將人K562細胞以3 X 105細胞/孔接種在5% FBS的IMDM的96孔 板中,。向不同量的測試抗體復(fù)合物中,，加入定量的放射標(biāo)記的抗體復(fù)合 物，然后向K562細胞中加入組合的混合物使得每孔含有終濃度0.1 w g/ml碘化的抗體復(fù)合物,。將孔板在4,。C孵育16-18小時,，用5% FBS的 imdm洗滌三次除去非結(jié)合的Ab后，應(yīng)用y計數(shù)器測定細胞結(jié)合的計數(shù)值,。

結(jié)果.隨著非標(biāo)記竟?fàn)幟庖邚?fù)合物量的增加,，會增加對放射標(biāo)記免疫復(fù)合物結(jié)合的抑制。唾液酸變體,，未改性的Abl(29,。/。唾液酸化)和Abl MAAB(43,。/,。唾液酸化)顯示：具有更高唾液酸化Ab的復(fù)合物與具有更4氐 唾液酸化Abl的復(fù)合物相比，產(chǎn)生相同程度的FcyRII結(jié)合需要5至10 倍的更高濃度(圖4A),。至于相差9%唾液酸含量(20對29)的天然變體 Abl,對于更低唾液酸化制品來說相差大約4倍的更高親合力（未展示）,。 因此，在這種人IgG 1上存在唾液酸的NGNA同分異構(gòu)體形式(作為鼠骨 髓瘤宿主細胞重組體表達的結(jié)果）,，減少了免疫復(fù)合物對人FcYRII的親合力,。

免疫復(fù)合物對K562細胞的結(jié)合.將Abl測試樣品與1251-標(biāo)記的人 TNF以2:1的固定摩爾比混合，然后向96孔培養(yǎng)皿中的3 X 105 K562 細胞中加入不同量的合成免疫復(fù)合物,。AblG2:TNF復(fù)合物(無唾液酸化 的Ab)與AblG2S2(hi):TNF復(fù)合物（完全唾液酸化的Ab)的對比顯示完全 唾液酸化的Ab具有親合力非常小的結(jié)合,，高唾液酸化的變體與無唾液 酸化的變體相比，達到相同程度的結(jié)合需要IO倍的更高濃度(圖4B),。 這些結(jié)果表明唾液酸的NGNA同分異構(gòu)體的存在(通過體外酶修飾的引 入)減少了抗體對人Fc y rii的親合力,，其可歸因于對靶(TNF)結(jié)合親和 力的減少，從而使Ab:TNF復(fù)合物的穩(wěn)定性更低,，減少恒定區(qū)對Fc受體 親和性,，或兩者。

與細胞Fc y RIIIa結(jié)合的Ab.為了分析與天然殺傷細胞(NK)Fc y RIIIa結(jié)合的Ab,如上所述分離出人PBMC,然后應(yīng)用NK細胞分離盒 (Miltenyi Biotec)通過磁細胞揀選從PBMC分離出NK纟田胞,。在96孔板 中以每孔1 X 105細胞將NK細胞在37°C, 5% C02下的10% FBS的 DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,。將抗Fc y RIIIa mAb 3G822 (BD Biosciences Pharmingen)用碘化法試管（Pierce)標(biāo)記1251至i文射性比度(specific activity) 為11 yCi/jug。將碘化的mAb 3G8與不同量的未標(biāo)記的竟?fàn)巹〢b在 10% FBS的DMEM中預(yù)混合,，向NK細胞中加入Ab混合物至硤化3G8 的終濃度為0.3 jug/ml,。將細胞在4。C孵育16小時,，然后用PBS洗滌4 次除去非結(jié)合的IgG,。應(yīng)用Y計數(shù)器測定CP結(jié)合細胞M的數(shù)值。

將在添加2 mM L-谷氨酰胺,、1 mM丙酮酸鈉和10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(U-937培養(yǎng)基）中培養(yǎng)過的U-937細胞(沒有為提高Fc yR表達進4亍預(yù)處理)接種至96孔澤反中,，使每孔具有3 X 105細胞的50 Ml U-937培養(yǎng)基。將Ab2(人IgGl)標(biāo)記1251至放射性比度為17 ju Ci/ ju g。 將碘化的Ab2 Ab與不同量的未標(biāo)記的竟?fàn)巹〢b2在U-937培養(yǎng)基中預(yù) 混合,。然后向50 ju 1 U-937細胞中加入50 m 1 Ab混合物,，以使所有孔 中碘化Ab3的終濃度為0.2 jug/ml。將細胞在4,。C孵育16小時,，然后用 U-937培養(yǎng)液洗滌三次除去非結(jié)合的IgG。應(yīng)用Y計數(shù)器測定CPM結(jié)合 細胞的數(shù)值,。

為了測試Ab變體是否對Fc y RIIIa顯示差別親和力,，新分離的NK 細胞是從健康人捐獻者中分離出的，并用于竟?fàn)幗Y(jié)合實驗,，所述實驗包 括放射標(biāo)記的mAb 3G8,、與Fc竟?fàn)幗Y(jié)合的抗Fc y RIIIa Ab、和作為竟?fàn)?劑的非標(biāo)記的Ab,。游離的,、未復(fù)合的Ab用于代替免疫復(fù)合物(其通常 顯示對cyRIIIa非常大的結(jié)合)，以便結(jié)果不會被可溶免疫復(fù)合物本身的 穩(wěn)定性差異所困惑,，所述穩(wěn)定性差異可能受到Fc唾液酸含量的影響(我 們的未公布的數(shù)據(jù)）,。這些結(jié)果顯示更高唾液酸化天然變體Abl(Ab 1-29) 對NK細胞上的Fc YRIIIa具有減少的親和力，與Ab l-20相比達到相同 程度的結(jié)合需要4倍的更高濃度(圖5A),。對于天然變體Ab5具有相似 的差異，其中與Ab5-0相比,，竟?fàn)帉筸Ab3G8至相同的程度,，Ab5-26 需要5倍的更高濃度(圖5B)。當(dāng)應(yīng)用至少兩者不同供血者的NK細胞(沒 有展示數(shù)據(jù),；沒有測定Fc yRIIIa異型）時,，在各自的實驗中觀察到相似 的結(jié)果。這些結(jié)果表明唾液酸化的更高水平可減少IgG對FcyRIIIa的 親和力,，因此,，幾乎必然地促成所測到的ADCC活性降低。

當(dāng)用凝集素分級分離所衍生的成對變體進行同樣的實驗時,，然而觀 察到更高唾液酸化的變體與FcyRIIIa結(jié)合正如更低唾液酸化的變體的 結(jié)合,，且也許稍更好些（圖5C和5D)。兩隊天然變體和兩隊凝集素衍生 變體的不同結(jié)果的原因是未知的,，但是相當(dāng)大的可能性是唾液酸殘基存 在的位置的差異,。

實施例4:體外ADCC測定

抗TNF Ab靶細胞包含Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞系，在其表面穩(wěn)定表 達由于導(dǎo)入刪除1-12位氨基酸的成熟TNF而保4爭^爭膜形式的重組體人 TNF(Perez等.,，1990),。將K2細胞在伊思考夫培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng) 基包含熱滅活的FBS,、 2mML-氨酰胺,、1 mM丙酮酸鈉,、O.lmM非必需的氨基酸、和MHX,。培養(yǎng)基和添加物購自Gibco (Invitrogen),。將細胞每 2-3天傳代l:5。測定的當(dāng)天,，將K2細胞離心并用PBS洗滌一次,。將細 胞用培養(yǎng)液調(diào)至大約1 x 106細胞/ml,加入15微升BATDA熒光標(biāo)記試 劑(于Delfia EuTDA Cytotoxicity Reagent Kit中，Perkin陽Elmer Life Sciences)至5 ml的細胞中（Blomberg等.,1996),。在37,。C將細胞孵育30 分鐘，然后用PBS在5分鐘1000 rpm下,，洗滌兩次,。與PBMC效應(yīng)細 胞混合即時前，將耙細胞離心,，并以2xl()S細胞/ml再懸浮于含1%BSA 的伊思考夫培養(yǎng)基中,。

在收集血液至肝素化真空采血管(vacutainer)并用PBS稀釋兩倍后， 從健康捐獻者中分離出PBMC效應(yīng)細胞,。在50ml圓錐形管中,，將三十 ml稀釋的血液分層置于Ficoll-Paque (Amersham, Uppsala, Sweden)上部 15 ml,并在室溫(RT)1500 rpm離心30分鐘。收集含PBMC的分界面（阻 擋層）,，用PBS洗滌兩次,，在RT,以1200 rpm離心10分鐘。將細胞再 懸浮于^f尹思考夫培養(yǎng)基中,，所述培養(yǎng)基包含5%熱滅活的FBS,、 2mML-氨酰胺、1 mM丙酮酸鈉和O.l mM非必需的氨基酸,。在37°C 5% C02 通過在100 mm組織培養(yǎng)皿(Corning)上孵育,，將PBMC活化大約4小時， 所述培養(yǎng)皿之前涂有OKT3 (10 ug/ml的PBS, Ortho Pharmaceutical)并在 4,。C過夜并用PBS清洗,。收集PBMC,用含1% BSA的伊思考夫培養(yǎng)基 洗滌一次；計數(shù)并再懸浮至大約1 x 107細胞/ml,。

將AM的測試樣品包括陰性對照變體AM Gno,連續(xù)用伊思考夫 -1% BSA培養(yǎng)液稀釋,。向圓底96孔皿(Cornmg)中加入50微升的耙細胞 (~ 10,000)和100微升的抗體。向混合物中加入五十（50)微升效應(yīng)細胞（~ 500,000細胞）,，將孔皿在RT下以1000 rpm離心5分鐘,。E:T的比值通 常為50:1，然而有時用35:1的比值。至于背景熒光,，將孔與效應(yīng)細胞,、 靶細胞和培養(yǎng)基一起孵育。至于最大的熒光,，向背景孔中加入10微升 溶胞液(來自Delfia EuTDA Cytotoxicity kit),。至于ADCC測定，在37°C 5% C02下將細胞孵育大約2小時,。將20微升的上清液轉(zhuǎn)移至96孔平 底板（Cornmg),。在RT下，力口入200微升的銪溶液(Delfia EuTDA CytotoxcityKit),并將板置于平板搖床振蕩10分鐘,。在時間分辨的熒光 i十En Vision Instrument (Perkin-Elmer Life Sciences)中測定焚光,。才艮寺居下 式計算各自樣品特異性溶胞的百分?jǐn)?shù):％特異性釋放=([實驗釋放-自發(fā)釋放]+ [最大釋放-自發(fā)釋放])X 100 。

39唾液酸效應(yīng)的最初評價集中于兩隊天然變體的體外ADCC活性,。將 Abl-29和Abl-20以不同的濃度同銪標(biāo)記的表達Agl的靶細胞一起孵育,。 如圖6A所示，在細胞毒性活力中具有明確的差異,，其中Fc唾液酸化更 高水平的Abl-29與Abl-20相比,，為激發(fā)細胞溶解至相同程度，需要大 約7倍的更高濃度,。這些結(jié)果表明富集唾液酸化糖形的AM子批,，Abl MAAB,比未改性的Abl PBS具有更少的效力。達到Abl PBS-29,。/o樣品 相同量的溶胞作用需要大約3倍值的Abl MAAB-43,。/。物質(zhì),。對于成對的 Ab2天然變體，表達Ag5靶細胞的實驗顯示為同樣的模式,。為了達到不 含可檢測量唾液酸的Ab2-0變體相同程度的溶胞作用,，需要大約6倍的 更高濃度的Ab2-26(如圖6B所示）。因此,，天然糖基化變體對這種ADCC 的測量值的作用不是Ab或靶特異性的,。

在比較Abl子批(基于凝集素分級分離后它們的唾液酸含量不同）的 ADCC活性的代表性實驗中，比較AM MAAB(43q/o唾液酸化)與衍生的 未改性的Abl批(Abl PBS),。在比較唾液酸含量不同的Abl子批的第二 個實-驗中,，將Abl WGAT (29%唾液酸化）、AblWGAR(40%唾液酸化) 和Abl WGAB(32%唾液酸化)相互進行比較,。

測定的結(jié)果也證明了在ADCC測定中唾液酸含量和潛能之間存在 反相關(guān)的關(guān)系,，而不考慮制備Ab的方式（圖6C)。就是說，含有與未改 性的Abl大約相同唾液酸量的Abl WGAT展示了與未改性的Abl相同 的活性,。然而,，WGA制備的部分隨著唾液酸含量的增加失去了潛能（圖 6C)。

實驗中,，比較了唾液酸量差別更大的兩種樣品:酶改性的Abl G2(0% 唾液酸化）和Abl G2S2(hi)( ~ 95%唾液酸化）,。通過密度離心法，在 Ficoll-Paque中分離出新鮮的PBMC,。將于100 ml體積中的5 X 105 PBMC 與不同量的未處理的Abl,、 AblG2S2(hi)(完全半乳糖化和唾液酸化）、或 Ab7(同種型配對的陰性對照Ab)—起預(yù)孵育大約10分鐘,。表達表面結(jié)合 的重組體人TNF的K2細胞被用作輩巴標(biāo)并標(biāo)記200 mCi51Cr,。將標(biāo)記的 細胞加至PBMC/Ab混合物中，在1000 rpm離心1分鐘,，然后在37°C孵 育4小時,。已知孵育時間（4小時)可出現(xiàn)NK細胞(在PBMC細胞種群內(nèi)） 引發(fā)的初始細胞的溶解，NK細胞表達Fc yRIIIA, FcyRIIIA不是由巨 噬細胞表達,，巨噬細胞通常表達Fc yRI (cd64),、 Fc yRIIA (cd32a)、 和FcyRIIIA(CD 16A),。然后應(yīng)用Topcount測定細胞上清液中放射活性2006數(shù),。所示的結(jié)果（圖6D)代表兩個應(yīng)用不同捐獻者的PBMC所完成的獨 立試驗，完全唾液酸化的Ab和幾乎去唾液酸化的Ab之間在細胞溶解的 能力顯示出大于IO倍的變化,。

在ADCC測定中也比較了其它成對的Ab制品,。在ADCC測定中應(yīng) 用表達Ag2的耙細胞，評價了由半乳糖化Ab2制成的WGA凝集素部分,。 此外,，更高唾液酸化的物質(zhì)具有更少的活性，然而在EC5o值上只有4 倍的差異,，盡管在唾液酸含量(5%對67%)存在更大的差異,。比較起來， 由Abl制成的WGA凝集素部分表明41%唾液酸化變體與29%唾液酸化 變體相比,，達到相同程度的細胞溶解需要大約6倍的更高濃度,。

所有測試的三對Ab的這些結(jié)果一致地表明Fc唾液酸的高水平與降 低的ADCC活性相關(guān)。雖然沒有定量,，ADCC活性的量級變化與Ab制 品唾液酸含量的量級變化之間的差異在四種Abl變體組內(nèi)存在一致的 關(guān)系,，其中Abl-20、 Abl-29,、 Abl-WGA-29,、和Abl-WGA-41的EC5,。值 一4殳分別0.3 ng/ml、 2 ng/ml,、 2 ng/ml和10 ng/ml,。凝集素部分的結(jié)果也 證實了唾液酸化Ab制品包含ADCC活性不同水平的分子種類。值得注 意的是,，除Ab3-0和Ab3-26之外,，本文所分析的變體沒有顯示達到溶 胞最大水平差異的趨向。

由于這種方法測量的ADCC活性主要是由Fc y RIIIA陽性NK細胞 所介導(dǎo)的,，數(shù)據(jù)意味著鑒于Fc寡糖中唾液酸的存在增強與FcyRI的結(jié) 合,，其存在顯著減少了與FcyRIIIA的結(jié)合。

實施例5:高親和性細胞的FC受體的結(jié)合

在人單核細胞的細胞系U-937細胞上應(yīng)用竟?fàn)幗Y(jié)合形式,，測量唾液 酸含量不同的受試Ab對高親和性人Fc受體FciRI(CD64)的結(jié)合,。在T 燒瓶中，將U-937細月包在2 mM L-谷氨酰胺,、1 mM丙酮酸鈉和10% FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),，且在37。C用5%002維持培養(yǎng)器,。應(yīng)用碘 化劑（IODO-Gen)預(yù)涂漬碘化管,將Ab2(鼠/人IgGl嵌合體Ab)碘化至放射 性比度為17.2 mCi/mg,。將U-937細胞以6 x 106細胞/ml再懸浮于新鮮的 培養(yǎng)基中，然后通過過濾器以每孔3 X 105細胞密度接種至Millipore 96 孔組織培養(yǎng)板中,。這些細胞沒有進行預(yù)處理以產(chǎn)生更高的Fc丄R表達,。 在50 yl的體積中，應(yīng)用培養(yǎng)基作為稀釋液將碘化的Ab2與不同量的 未標(biāo)記的Mab竟?fàn)巹y試樣品)預(yù)混合,。然后將混合物加至U-937細胞的50 jul培養(yǎng)基中,，得到最終碘化Ab2的濃度為0.2 ng/ml。然后將細 胞在4,。C孵育16小時,。用培養(yǎng)液清洗以除去非結(jié)合的IgG,應(yīng)用板真空 系統(tǒng)抽吸三次。應(yīng)用Y計數(shù)器測定細胞結(jié)合的計數(shù)值,。

圖7 A展示與AblG2(無唾液酸)相比,，Abl G2S2(hi)( ~ 95%唾液酸 化)與U-937細胞上的高親和性FcR (CD64)的結(jié)合具有5 ~ 10倍更高的 親和性，亦即,Abl G2S2(hi)達到抑制碘化Ab2結(jié)合的相同程度時,，只需 要五分之一至十分之一的濃度。沒有4企測到Abl G2與未處理的Ab之間 的差異(數(shù)據(jù)未展示）,，未處理的Ab是不同糖形的異種混合物,，其大多數(shù) 含有比Abl G2樣品更少的半乳糖（即GO和Gl糖形）。

圖7B展示了兩種不同批次的Ab3具有不同量的帶電荷寡糖種類 (含有唾液酸的種類）,，或者為總寡糖的2%或42%,，同樣表明了具有更高 唾液酸含量為特;[正的批次對Fc y RI具有更高的親和性,。

在觀察到兩隊天然糖基化變體Abl和Ab5中更高唾液酸含量的抗 體制品具有與NK細胞Fc YRIIIa減少的結(jié)合后（實施例3,圖5A和B), 這些結(jié)果的可能性被認(rèn)為是由于帶負電荷的唾液酸和帶負電荷的細胞 表面之間簡單的靜電排斥。然而,唾液酸含量對人U-937細胞Fc yRI受 體的結(jié)合親和性的相反影響并沒有遵循Ab5或其它Ab的相同模式(數(shù)據(jù) 未顯示),。

應(yīng)當(dāng)指明的是,，鑒于兩種Abl樣品在缺失/存在唾液酸NANA形式 中的不同，因而認(rèn)為兩種Ab3樣品在唾液酸NANA形式的量上不同（鼠 宿主細胞生產(chǎn)的）,。

實施例6:血清半衰期的測量

在本實施例中,，將含有Fc的融合蛋白（其包含與小鼠骨髓瘤細胞表 達的抗體可變區(qū)序列和人IgGl鉸鏈、CH2和CH3區(qū)域稠合的N末端肽) 處理以形成完全唾液酸化(G2S2)的形式,。對正常雌性CD1大鼠(每處理 組4個)靜脈注射給予未改性的形式的FcPl(其含有5%唾液酸化的Fc寡 糖）或?qū)⑼耆僖核峄褪剑▇ 98,。/。唾液酸化）由I,月永內(nèi)分組注射^會J難性 CD1大鼠,。在1小時,、5小時、24小時,、72小時,、7天、14天,、和21 天通過后眼窩取血收集血液,，然后在28天通過對c02麻醉的動物進行 心臟穿刺的最后采血。由血樣制備血清,，應(yīng)用比色法ELISA測量血清中 人Fc的濃度,。簡言之，首先將96孔EIA板涂上多克隆的山羊抗人Fc抗體,。在室溫下將不同稀釋度的血清樣品在孔中孵育1小時,。通過清洗 除去非結(jié)合的蛋白質(zhì)，根據(jù)適當(dāng)?shù)闹孜?，?yīng)用酶結(jié)合的山羊抗人IgG抗體測定結(jié)合的人Fc,。

圖8中顯示了研究結(jié)果。未改性抗體計算的曲線下面積(AUC)為95 ± 1.6天.ng/mlXK)-3和48 ± 1.9天? ng/mlX10-3,。這表明Fc寡糖中 更高程度的唾液酸化與正常大鼠中更快的清除速率有關(guān),。

在第二個實驗中，給正常小鼠注入單個3 mg/kg劑量的酶修改為完 全無唾液酸化或（G2)完全唾液酸化(G2S2)的Ab2,。應(yīng)用如上所述的比色 法ELISA,監(jiān)測和測量血清中的人Fc,。圖9中顯示了此實驗結(jié)果。在大 約一周時期后,，Ab2 G2S2開始被更快地從小鼠血清中清除,至第20天血 清中剩下的Ab2 G2S2大約1000倍地小于Ab2-G2的濃度,。

小鼠體循環(huán)中Abl唾液酸變體的清除

在注射含有與AM結(jié)合的異種混合聚糖種類的樣品后，通過定量測 定各個糖基化種類的血清清除速率,，進行唾液酸含量效應(yīng)的另一種直接 測量,。

以20 mg/kg的劑量給18個正常的8-10周齡的Balb/c小鼠腹腔內(nèi)注 入同樣的異種糖基化的制品Abl,。在第3天從6個小鼠中、在第6天從 另外6個小鼠中和在第28天從最后6個小鼠中采集血液,。從各個血樣 中制備血清,，應(yīng)用Abl V區(qū)特異性抗Id親和柱，將血清中的Abl重純 化,。然后通過HPLC分析對重純化的Abl樣品的Fc聚糖的結(jié)構(gòu)進行分 析,，如本文先前所述測定各種糖形的相對比例。

發(fā)現(xiàn)了缺乏唾液酸的半乳糖化糖形（G2S0)在小鼠4周期內(nèi)保持其相 對豐度,，而含有1個唾液酸聚糖(G2S1)的Ab糖形和2個唾液酸(G2S2) 糖形以更快的速度^f皮清除,。

因此，與無唾液酸4t或部分唾液酸^:組成相比,，含完全唾液酸4匕的 Fc蛋白質(zhì)具有更短的血清半衰期,。

實施例7:唾液酸含量和抗體親合力

此處所述的結(jié)果支持Fc區(qū)域(二聚化鉸鏈-CH2-CH3)Fc聚糖中的唾 液酸含量的變化將影響整個蛋白質(zhì)的理論。至于包含糖基化Fc的二價 抗體和融合蛋白,，這種影響可在蛋白質(zhì)對特異靶標(biāo)的親合力中得到證 明,。進行本實施例的實驗以驗證這種理論，并進一步證實唾液酸含量對靶結(jié)合親合力的特異性作用,。

與細胞表面抗原的結(jié)合.在結(jié)合測定中應(yīng)用上述ADCC測定中所用 的表達Ag的相同細胞系,，以測試唾液酸變體之間在其抗原結(jié)合親合力中的差別。測定以竟?fàn)幮问竭M行,，其中將一個放射標(biāo)記的Ab(Abl,、 Ab2、 或Ab5)保持固定的濃度與表達Ag的細胞一起在不同量的未標(biāo)記的測試 Ab存在下孵育,。通過碘化劑方法制備的捵化的Ab通常為10 uCi/ug的 放射性比度,。

在5% FBS的MDM培養(yǎng)基中，將表達表面TNF的細胞以每孔50,000 個細胞和表達Ag2的細胞以每孔180,000個細胞接種于96孔組織培養(yǎng) 皿,。將適當(dāng)?shù)?251標(biāo)記的Ab與滴定量的測試Ab預(yù)混合,，并將混合物加 到適當(dāng)表達Ag2的細胞中。在RT將皿孵育2小時以使Ab與細胞結(jié)合,。 用5% FBS的IMDM將這些細月包清洗三次以除去非結(jié)合的Ab,然后應(yīng)用Y計數(shù)器測定細胞結(jié)合的計數(shù)值,。

至于Ab5變體，在50 ju 1 10% FBS的DMEM中,，將表達Ag5的細 胞以每孔186,000個細胞接種于96孔組織培養(yǎng)皿,。將1251標(biāo)記的Ab2與 滴定量的測試Ab預(yù)混合，并將50 )i 1混合物加到適當(dāng)表達Ag的細胞 中,。在4,。C將皿孵育16小時以使Ab與細胞抗原結(jié)合。然后用10%FBS 的DMEM將這些細胞清洗三次以除去非結(jié)合的Ab,然后應(yīng)用y計數(shù)器 測定細胞結(jié)合的計數(shù)值,。將樣品一式雙份或四份進行檢測,，所示結(jié)果表 示3或4次獨立試驗的結(jié)果。按照平方和增量F-檢驗確定時,，這些測試 樣品之間的結(jié)合差異是顯著的(P〈0.0001,圖a,、 c、和d),。

這些結(jié)果展示在圖10A-D中：在作為竟?fàn)巹┑奈礃?biāo)記Abl天然變 體存在下,，放射標(biāo)記的Abl與表達Agl細胞的結(jié)合（圖10A);在作為竟 爭劑的未標(biāo)記Ab5天然變體存在下，放射標(biāo)記的Ab5與表達Ag5細胞 的結(jié)合(圖10B);在作為竟?fàn)巹┑奈礃?biāo)記Abl凝集素衍生變體存在下,， 放射標(biāo)記的Abl與表達Agl細胞的結(jié)合(圖10C);在作為竟?fàn)巹┑奈礃?biāo) 記Ab3凝集素衍生變體存在下,，放射標(biāo)記的Ab3與表達Ag3細胞的結(jié) 合（圖IOD)。

與固相配體結(jié)合的Ab.通過向每個孔中加入于PBS中的濃度為1 jug/ml的50 MlAg或抗IdAb,并將板在4°C孵育過^復(fù),， -使重組可溶的 TNF或抗Id2涂布在EIA板上,。將孔清洗，然后在RT用50 ju 1 1% BSA,、 0.125%明膠的PBS預(yù)處理1小時,，以使非特異性結(jié)合降到最低。將1251標(biāo)記的Abl或1251標(biāo)記的Ab3在5% FBS的IMDM中分別與滴定量的各 個測試Ab制品預(yù)混合,，并將50 jul混合物加到涂布耙標(biāo)的孔中,。所有 孔中放射標(biāo)記的Ab終濃度為100 ng/ml。在RT將這些板孵育2小時以 使Ab與涂布的耙標(biāo)結(jié)合,。將這些孔清洗以除去非結(jié)合的Ab,然后應(yīng)用 Y計數(shù)器測定結(jié)合的計數(shù)值,。

板上涂布的Ab與可溶性抗原的結(jié)合.將96孔板涂上唾液酸變體 Abl和Ab3,然后與不同量的放射標(biāo)記的可溶性抗原一起孵育如下:(a) 放射標(biāo)記的可溶Agl與板上涂布的AM天然變體的結(jié)合,(b)放射標(biāo)記的 可溶Agl與板上涂布的Abl凝集素分級分離的變體的結(jié)合,和(c)放射標(biāo) 記的可溶Ag3與板上涂布的Ab3凝集素分級分離的變體的結(jié)合。用放射 標(biāo)記的Ag和IO(H咅過量的未標(biāo)記的Ag進4亍對比孵育,，以測定非特異性 結(jié)合,。樣品一式三份進行測試。由于沒有可利用的可溶Ag2,沒有分析 Ab2變體,。

統(tǒng)計分對斤.通過比較曲線并同時應(yīng)用4-參數(shù)的邏輯回歸（logistic regression):共同的最小數(shù),、最大數(shù)和斜率(根據(jù)初步試驗的斜率)和對于 零濃度所得到的共同穩(wěn)態(tài)水平（common plateau)的范圍（亦即,通常假定 對于遞增曲線沒有測驗共同的"底部"和對于遞減曲線沒有測驗共同的 頂部），分析了抗體變體之間的效能差異,。在GraphPad Prism v4中用平 方和增量F-檢驗進行顯著性檢驗,。P值〈0.05被認(rèn)為有顯著性。對CPM 分析被CPM2相反地加權(quán),，因為CPM的標(biāo)準(zhǔn)差對其平均值按比例地增 力口 （亦即,，CPM變異系數(shù)CV與平均值是不相關(guān)的）。

結(jié)果

應(yīng)用ADCC測定所用的表達Ag相同的靶細胞,，以竟?fàn)幮问剿M行 的的抗原結(jié)合實-驗出乎意料地顯示了與Abl-20相比,，Abl-29 —致地結(jié) 合細胞表面抗原，具有大約3倍的更低親和性（圖10A),。相反地,，Ab5-26 顯示與Ab5-0不能區(qū)別的親和性（圖IOB),。用兩隊凝集素衍生的變體所 進行的相同測定顯示與Abl天然變體類似的結(jié)果，亦即,更高唾液酸化 的Abl-WGA-41與4交少唾液酸化的Abl-WGA-29相比,，達到相同程度的 竟?fàn)幮越Y(jié)合需要4至6倍的更高濃度（圖10C),和更高唾液酸化的 Ab2-GT-WGA-67與較少唾液酸化的Ab2-GT-WGA-5,，需要4至6倍的 更高濃度（圖1 OD)。

有趣地,，在測定與固定在96孔EIA一反上的耙(可溶重組體抗原或抗45Id Ab)結(jié)合的實-驗中,，也觀察到更高量的唾液酸化Abl和Ab2變體具有 降低結(jié)合的相同模式（圖11A和B)。這些結(jié)果表明Fc唾液酸化程度的 差異可能影響到與抗原以及FcyRIIIA的結(jié)合,，但是唾液酸化的程度不 能影響所有的Ab結(jié)合抗原,。

根據(jù)固定靶結(jié)合的數(shù)據(jù)，可以認(rèn)為增加Fc唾液酸化可用于降低Ab 鉸鏈區(qū)的柔性,。在Abl和Ab2結(jié)合細胞表面抗原的情形中,，降低鉸鏈柔 性可導(dǎo)致更多的單價結(jié)合和更少的二價(高親合力）結(jié)合到抗原，這取決 于固體載體或細胞表面上的抗原表位的間距,。Ab5鉸鏈區(qū)也可降低柔性,， 但是這種Ab達到與Ag5最大結(jié)合可能不需要這種柔性。

為了區(qū)別Ab的柔性效應(yīng)或固有結(jié)合親和性的變化之間是否受到Fc 唾液酸化的影響,，測試了 Ab與可溶配體的結(jié)合,，作為純粹單〗介親和性 的結(jié)合。這些結(jié)果確實表明了：對于在與細胞表面抗原結(jié)合中表現(xiàn)出差 異的三對唾液酸變體,，在它們與可溶^i結(jié)合中成對變體之間沒有,，見察到 可檢測的差異(圖12A-C)。 一并考慮,，這些結(jié)果證實了與固定靶(細胞表 面或板上涂布的）結(jié)合的這些差異不是由于各個Fab臂和靶之間的固有 親和力的差異,。因此，Abl和Ab2唾液酸變體在它們與固定革巴結(jié)合之間 的這些差異是由于與細胞二價結(jié)合程度的差異,。

應(yīng)當(dāng)澄明本發(fā)明可以以除前述說明書和實施例中具體所述之外的 方式實施,。根據(jù)上述教導(dǎo)對本發(fā)明進行眾多的修飾和變更是可能的，這 在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi),。