文章的題目是The E3 ubiquitin ligase WWP2 facilitates RUNX2 protein transactivation in a mono-ubiquitination manner during osteogenic differentiationE3,，作者是復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系暨代謝分子醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘肖箐課題組的師生,，在這篇文章中作者發(fā)現(xiàn)泛素連接酶 WWP2 以單泛素的方式促進(jìn) RUNX2 蛋白在成骨分化過程中的轉(zhuǎn)染,。

研究背景：造血源性破骨細(xì)胞可以控制骨吸收,，骨骼間充質(zhì)成骨細(xì)胞促進(jìn)骨礦物質(zhì)沉積，這兩個(gè)過程的不平衡會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥,。而間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化促進(jìn)NEDD 4家族E3泛素蛋白家族成員的WWP 2表達(dá)及核內(nèi)積聚,，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞中敲除WWP 2基因?qū)е鲁晒枪δ芟陆担V物質(zhì)沉積減少和成骨標(biāo)記基因的下調(diào),。RUNX2（core binding factor alphal 1）是Runt家族轉(zhuǎn)錄因子的成員之一,，它們含有共同的DNA結(jié)合runt結(jié)構(gòu)域，能與核心結(jié)合因子β（core binding factor betaCbfb) 形成異二聚體,。RUNX2在軟骨形成,、骨代謝相關(guān)疾病方面至關(guān)重要，它能誘導(dǎo)骨骼間充質(zhì)細(xì)胞的分化,，并使間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化,，抑制脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化。具有顱骨鎖骨發(fā)育不全綜合征的患者RUNX22發(fā)生突變,，其表現(xiàn)為身材矮小,、鎖骨發(fā)育不全、多生牙和囪門不能閉合,。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲出小鼠的RUNX2基因,，小鼠軟骨形成分化完全中斷，說明其在軟骨發(fā)育中的重要作用。免疫共沉淀結(jié)果顯示W(wǎng)WP 2與RUNX 2相互作用,，WWP 2通過可以促進(jìn)runx 2的單泛素化,，進(jìn)而促進(jìn)成骨分化。

研究結(jié)果：作者為了證明Hect結(jié)構(gòu)域促進(jìn)WWP 2在胞質(zhì)積累,，首先利用體外培養(yǎng)的C3H10T1/2細(xì)胞分化模型,，檢測(cè)出WWP 2在成骨前后細(xì)胞中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)成骨后細(xì)胞中WWP 2的表達(dá)有所增加,。在成骨分化過程中,，WWP 2在間充質(zhì)干細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位發(fā)生改變，免疫熒光結(jié)果顯示WWP 2蛋白在成骨細(xì)胞中有更明顯的核定位,。

接下來作者將HA標(biāo)記的WWP 2蛋白截短突變體導(dǎo)入HEK293T細(xì)胞,，并進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)無C2結(jié)構(gòu)域,、非保守區(qū)或WW結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)WWP 2和截短的WWP 2蛋白具有相似的細(xì)胞質(zhì)定位,，而缺乏催化Hect結(jié)構(gòu)域的WWP 2蛋白的在核內(nèi)大量積累。這一結(jié)果表明在沒有Hect結(jié)構(gòu)域的情況下,，WWP 2蛋白本身就能主動(dòng)地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中,。接下來實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建RAN^T24N蛋白進(jìn)一步證明了作者的猜想：Hect結(jié)構(gòu)域的存在阻斷了WWP 2蛋白的核定位信號(hào)(NLS)4，即C端Hect結(jié)構(gòu)域?qū)WP2核轉(zhuǎn)運(yùn)有負(fù)調(diào)控的作用,，它能抑制WWP 2進(jìn)入細(xì)胞核,。

     隨后，作者證明出WWP 2對(duì)成骨分化和RUNX 2轉(zhuǎn)錄活性有正調(diào)節(jié)作用,，實(shí)驗(yàn)從小鼠股骨中分離出原代成骨細(xì)胞,，用病毒將WWP 2干擾的shRNA轉(zhuǎn)移到C3H10T1/2細(xì)胞中，對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定,，發(fā)現(xiàn)shRNA可以降低RUNX2的活性，抑制WWP 2表達(dá),，進(jìn)而阻斷成骨細(xì)胞的成骨分化,。

為了弄清WPP2究竟是對(duì)RUNX2的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域哪個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行調(diào)節(jié)從而使其轉(zhuǎn)錄活性升高，芯片分析結(jié)果顯示W(wǎng)WP 2沒有增加RUNX2與具有DNA結(jié)合活性的輔因子CBFB的親和力,，即WWP 2不影響RUNX 2與DNA的結(jié)合,，WWP 2不參與RUNX 2 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的調(diào)控。

為了驗(yàn)證WPP2可以調(diào)控RUNX2的轉(zhuǎn)錄激活域,，實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建DBD- RUNX2,，使用GAL 4報(bào)告基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DBD- RUNX2的轉(zhuǎn)錄活性,，受WPP2共同表達(dá)的刺激,。這一結(jié)果表明WWP 2增強(qiáng)了RUNX 2的轉(zhuǎn)錄激活活性，而非DNA結(jié)合能力。

那么WWP 2是否參與了間充質(zhì)干細(xì)胞成骨過程中RUNX 2泛素化呢,？實(shí)驗(yàn)通過在HEK293T細(xì)胞中共同表達(dá)了RUNX 2和His泛素,，發(fā)現(xiàn)泛素結(jié)合的RUNX 2蛋白被Ni-NTA柱拉下，Western blotting結(jié)果顯示W(wǎng)WP 2共表達(dá)誘導(dǎo)RUNX 2泛素化,。Ub-K0是一種變異的泛素,，其中7個(gè)賴氨酸殘基都被精氨酸殘基取代，可以防止聚泛素鏈的形成,，RUNX 2在Ub-K0表達(dá)細(xì)胞中的泛素化模式與野生型泛素表達(dá)細(xì)胞相似,，說明WWP 2將RUNX 2單一泛素化。

最后作者找到了泛素化過程涉及多種氨基酸殘基,，發(fā)現(xiàn)Lys-202, Lys-225, and Lys-240在WWP2對(duì)RUNX2的泛素化過程中必不可少,。

總結(jié)這篇文章，WWP 2以非蛋白水解,、單泛素化的方式催化RUNX 2,，促進(jìn)成骨分化。在此過程中,，C端Hect結(jié)構(gòu)域?qū)WP2核轉(zhuǎn)運(yùn)有負(fù)調(diào)控的作用,，抑制WWP 2進(jìn)入細(xì)胞核，而WWP 2通過增強(qiáng)RUNX 2的轉(zhuǎn)錄激活活性進(jìn)而調(diào)節(jié)成骨分化,，氨基酸殘疾Lys-202,、Lys-225和Lys-240在此過程必不可少。