S.aureus是一種病原體,，可引起廣泛的急性化膿性感染，如菌血癥,、心內(nèi)膜炎,、膿腫、脊髓炎和肺炎等,。由于耐甲氧西林S.aureus（MRSA）的傳播,，細(xì)菌感染的治療變得越來(lái)越成問(wèn)題。此前在醫(yī)院流行的MRSA菌株，現(xiàn)在已知可以傳播到外部環(huán)境,，并已從食物和牲畜中分離出來(lái),。S.aureus生物膜由細(xì)菌細(xì)胞嵌入“糖萼”組成，糖萼主要由細(xì)菌胞外聚合物（EPS）組成,。EPS可以介導(dǎo)生物膜與表面的粘附,，提供機(jī)械穩(wěn)定性，并有助于生物膜內(nèi)聚三維聚合物網(wǎng)絡(luò)的建立,。細(xì)菌生物膜起到保護(hù)細(xì)菌的屏障作用,，降低細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性，因此抗生素對(duì)這些生物膜相關(guān)病原體的療效較差,。這些問(wèn)題正成為食品安全的新問(wèn)題,，迫切需要開(kāi)發(fā)新型的S.aureus和細(xì)菌生物膜抗菌劑。

內(nèi)溶酶是噬菌體在其裂解復(fù)制周期結(jié)束時(shí)產(chǎn)生的水解酶,，其能夠通過(guò)消化肽聚糖聚合物來(lái)破壞細(xì)菌細(xì)胞壁,，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的低滲裂解。與噬菌體和常規(guī)抗生素相比,，內(nèi)溶素具有宿主特異性,，無(wú)論在細(xì)菌處于何種生理狀態(tài)都能迅速殺死細(xì)菌，且不易產(chǎn)生耐藥性,。此外,，內(nèi)溶素可以殺死嵌入在生物膜基質(zhì)中的復(fù)制和非復(fù)制的細(xì)菌，從而破壞細(xì)菌的生物膜,。噬菌體來(lái)源的內(nèi)溶素在對(duì)抗革蘭氏陽(yáng)性菌的耐藥菌株及其生物膜合成方面具有重大作用,。以往的研究主要評(píng)估了內(nèi)溶酶對(duì)S.aureus及其生物膜的控制效果，但是關(guān)于內(nèi)溶素及其結(jié)構(gòu)與在溶膜和抗生物膜活性方面的研究很少有報(bào)道,。本研究分離了感染S.aureus ATCC43300的強(qiáng)毒噬菌體qdsa002,，并對(duì)其形態(tài)和基因組進(jìn)行了表征。

1. 實(shí)驗(yàn)材料：青島市污水中分離得到的強(qiáng)毒噬菌體qdsa002

2. 分析內(nèi)容：噬菌體基因組測(cè)序,、噬菌體形態(tài)學(xué)鑒定,、內(nèi)溶酶基因克隆&表達(dá)&純化和生理生化鑒定等等。

1. 噬菌體qdsa002的形態(tài)學(xué)和基因組分析

使用菌斑純化技術(shù)從青島市污水中分離得到S. aureus噬菌體qdsa002,，TEM顯示,，該噬菌體是Myoviridae家族的一員，其頭部等距,，尾部可收縮,。將噬菌體qdsa002與Myoviridae家族下的Twort-like噬菌體基因組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其與噬菌體GH15,、MSA6,、G1,、IME-SA1、Sb-1,、K和ISP具有較高的同源性(同源性大于62.72%),，與其他噬菌體的同源性在36.02% ~ 37.82%之間。對(duì)該噬菌體進(jìn)行高通量測(cè)序,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因組大小為142,499bp,，GC含量為30.26%，231個(gè)ORF,，其中有64個(gè)注釋到相應(yīng)的功能,。

圖1  噬菌體qdsa002的形態(tài)圖及基因組圈圖

2. 噬菌體qdsa002可能內(nèi)溶素的生物信息學(xué)分析、表達(dá)和純化

對(duì)噬菌體qdsa002基因組進(jìn)行生物信息學(xué)分析,，發(fā)現(xiàn)該噬菌體具有由穿孔素和內(nèi)溶素兩部分組成的裂解系統(tǒng),。其中ORF84編碼推測(cè)為內(nèi)溶酶（命名為L(zhǎng)ys84），該基因具有兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域：一個(gè)CHAP結(jié)構(gòu)域（半胱氨酸和組氨酸以來(lái)的酰胺水解酶/肽酶）和一個(gè)中心Amidase_2結(jié)構(gòu)域,，一個(gè)細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域SH3b,。對(duì)該基因進(jìn)行克隆、純化和表達(dá),，獲得了更多的Lys84產(chǎn)量,；SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的Lys84以可溶性蛋白和包涵體的形式存在,；純化出的溶出蛋白Lys84的蛋白帶長(zhǎng)度約為54K,，與預(yù)測(cè)的分子量（54.8K）相一致。

圖2  內(nèi)溶酶Lys84的鑒定

3. Lys84的裂解活性

使用濁度還原法評(píng)估純化后的Lys84裂解活性,，如圖所示,，所有的樣本OD595nm的初始值都接近1.40，5h內(nèi),，對(duì)照組的OD595nm值基本穩(wěn)定,，而2.5、5.0,、10和20um Lys84處理組的OD595nm值分別從1.37下降到0.81,、0.41、0.21和0.24,。

圖3 經(jīng)Lys84處理的S. aureus懸浮液的OD595nm值

4. 噬菌體qdsa002和Lys84的裂解譜

對(duì)噬菌體qdsa002和Lys84的裂解譜進(jìn)行鑒定,，結(jié)果表明,，噬菌體qdsa002能對(duì)38株供試菌株中的32株進(jìn)行裂解,，與噬菌體qdsa002相比，內(nèi)溶素Lys84具有更寬的溶出譜,，能夠溶解所列出的所有S. aureus菌株,。

表1 噬菌體qdsa002和Lys84的裂解譜

5. Lys84的生物膜較少效果

通過(guò)掃描電鏡觀察和結(jié)晶紫染色觀察Lys84對(duì)S. aureus生物被膜的影響,，對(duì)照組的SEM顯示，培養(yǎng)72h后形成的S. aureus生物膜牢固,，細(xì)胞聚集緊密,。與對(duì)照組相比，5um Lys84處理組的生物被摸基質(zhì)和細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量顯著減少,。此外,，10um Lys84處理2h后，幾乎所有的細(xì)菌被摸和細(xì)胞都被去除,。結(jié)果表明,，Lys84濃度大于10um時(shí)，可以有效去除S. aureus的生物膜,。

圖4 Lys84對(duì)S. aureus生物膜的影響

6. Lys84結(jié)構(gòu)域的表達(dá)與純化

分析克隆了3個(gè)Lys84結(jié)構(gòu)域,，在E.coli BL21中表達(dá)并通過(guò)親和層析純化，CHAP,、Amidase_2,、SH3b的SDS-PAGE結(jié)果顯示其分別在18、26,、12kda處有一條蛋白帶,。

圖5 SDS-PAGE分析(A)CHAP;(B)Amidase_2;(C)SH3b

7. Lys84及其結(jié)構(gòu)域的裂解活性比較

經(jīng)Lys84處理的金黃色葡萄球菌懸液及其結(jié)構(gòu)域組合的OD595 nm值如圖下圖所示，SH3b的對(duì)照組和處理組的OD595 nm值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,，表明Lys84的CBD不具有溶解能力,。而Lys84及其兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域CHAP和Amidase_2對(duì)S. aureus均具有一定的降解活性，其OD595 nm值分別降低了1.05,、0.64和0.62,。CHAP和Amidase_2聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)菌光密度的降低顯著高于單獨(dú)應(yīng)用CHAP和Amidase_2，但仍略低于Lys84,。同時(shí),，CHAP、Amidase_2和SH3b組合對(duì)S. aureus的降解活性有限,，僅使菌懸液的OD595 nm值降低0.49,。

圖6 Lys84及其結(jié)構(gòu)域組合對(duì)S. aureus的裂解活性

8. Lys84蛋白及其結(jié)構(gòu)域抗生物膜活性的比較

與對(duì)照組相比，Lys84去除了S. aureus生物膜生物量的88.01%,。CHAP,、Amidase_2和SH3b處理后細(xì)菌生物膜丟失的比例分別為74.20%、61.70%和0.52%,。同時(shí),，CHAP、Amidase_2和CHAP,、Amidase_2,、SH3b組合分別造成S. aureus生物被膜損失的75.06%和44.30%

圖7 Lys84及其結(jié)構(gòu)域組合對(duì)S. aureus的抗生物被膜活性

本研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自噬菌體qdsa002的溶菌素Lys84對(duì)S. aureus及其生物膜具有較強(qiáng)的溶菌活性和抗生物膜活性,；Lys84的溶解和抗生物膜活性主要依賴與CHAP和Amidase_2結(jié)構(gòu)域。此外,，Lys84需要結(jié)構(gòu)域的組裝以獲得最佳的構(gòu)架,，從而獲得最大的活性。因此,，本研究為L(zhǎng)ys84及其結(jié)構(gòu)域在食品工業(yè)中對(duì)S. aureus及其生物膜的應(yīng)用提供了理論依據(jù)和參考,。