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聽說最近大家的朋友圈被組學(xué)君家的Nanopore 兩大利器——MinION和GridION刷屏了,，組學(xué)君的座機(jī)（400-027-1221,，廣告一下組學(xué)君專機(jī)O(∩_∩)O）也被咨詢Nanopore的電話打爆了，大家熱情這么高,，組學(xué)君也不能辜負(fù),，于是從未來組最專注的基因組組裝方向，為大家整理了幾篇已公布的基于Nanopore測序基因組文章,，先讓大家一睹為快,，當(dāng)然，Nanopore測序到底如何,？你不來未來組試試如何知道,，組學(xué)君等你。 萬事開頭難,，先從模式物種來 Whole genome sequencing and assembly of a Caenorhabditis elegans genome with complex genomic rearrangements using the MinION sequencing device (2D) ONT sequencing library(SQK-LSK108),，上機(jī)4 MinION flowcells（R9.0）48hrs (1D) ONT sequencing library（SQK-RAD001），上機(jī)2 MinION flowcells（R9.3）48hrs （Figure 1） Figure1 MinION 測序 共下機(jī)1.1M reads,，read長度最長123,159 bp (平均長度 4,801 bp),，其中5.33Gb 1D堿基,，其互補(bǔ)鏈的2D 序列有1Gb,，1D 序列比對率為~93%，2D比對率90-95%,，其中,，3號染色體上有~3M的duplication（chrIII:10,062,096-11,973,739）（Figure 2）。 Figure2 MinION read 比對到參考基因組 經(jīng)Nanopore數(shù)據(jù)組裝可到145 Contigs,，Contig N50 = 1.22 Mb,，覆蓋了參考基因組的99%序列。研究者并用短讀長數(shù)據(jù)做了比較,，經(jīng)Illumina平臺的~8.04 G數(shù)據(jù),，組裝得到38,645 Contigs，Contig N50 = ~26 kb,。通過MinION 的基因組組裝結(jié)果,，同時(shí)還確定了重排和插入的復(fù)雜區(qū)域結(jié)構(gòu)。 High contiguity Arabidopsis thaliana genome assembly with a single nanopore flow cell typical consumer computing hardware (4 Cores, 16Gb RAM) 1 μg gDNA ,，(1D) ONT sequencing library (SQK-LSK108)（~3h）,，a single ONT MinION flowcell (R9.4) 48hrs 平均讀長11.4K（N50 7.5 kb），3.4G base-called sequence,，平均質(zhì)量值Q7.3,，其中200k以上reads有4條，最長有269K，超過100kb有14條reads,，50k以上有2317條reads,。 文中經(jīng)多種組裝軟件測試，其中,，minimap/miniasm組裝少于1hr,，racon (3x)consensus 12 hrs，pilon 進(jìn)行polish 24 hrs,。 ONT minimap/miniasm (ONTmin) 組裝得到62 Contigs,，ContigN50=12.3 Mb，覆蓋了100% (119 Mb) 的非重復(fù)序列（Table 1）,，經(jīng)BioNano光學(xué)圖譜數(shù)據(jù)驗(yàn)證了其高連續(xù)性,，并經(jīng)PacBio RSII數(shù)據(jù)驗(yàn)證其高堿基質(zhì)量。 最后研究者不忘計(jì)算此次Nanopore測序組裝項(xiàng)目成本,，總共花費(fèi)了4天時(shí)間,，以及包括儀器折舊和測序耗材在內(nèi)1000美金。 Table 1 OxfordNanopore (ONT) 和Pacific Biosciences (PB)組裝比較 模式物種搞定,，再來點(diǎn)非模式物種 Reconstructing the Gigabase Plant Genome of Solanum pennellii using Nanopore sequencing 通過2種片段方式建庫： a. 富集長片段（12-80 kb,，12-50 kb）建庫，(1D) ONT sequencing library (SQK-LSK108),，20 μg DNA/library,，29 ONT MinION flowcell (R9.4) b. 未經(jīng)片段篩選建庫，24 μg DNA/2 library,，2 ONT MinION flowcell (R9.4) 共下機(jī)數(shù)據(jù)131.6G,，平均一個(gè)Cell 4G產(chǎn)量，passed filter（Metrichor 1.121 base caller） 數(shù)據(jù)有110.96G（基本上是預(yù)估基因組1-1.1G的100X測序量）,，過濾后的平均Q-score為7.44,，在文庫優(yōu)化后，平均讀長在6,625-15,869bp間,，最長read達(dá)153,099bp,。 提取40%，60%,，80%數(shù)據(jù)量,，經(jīng)miniasm,Canu和 SMART de novo 進(jìn)行組裝測試，并經(jīng)二代數(shù)據(jù)polish,，其中Canu-SMARTdenovo效果最優(yōu)：Contig N50 達(dá)2.5 Mb（Figure 3）,。 Figure3 不同組裝策略對比 Rapid de novo assembly of the European eel genome from nanopore sequencing reads 在血液和肝臟組織中提取High MW DNA，片段化到20 kb,，構(gòu)建不同文庫： ONT sequencing library （2D：SQK- MAP006）,，于ONT MinION flowcell（R7.3）上機(jī),； ONT sequencing library （2D：SQK-NSK007和1D：SQK-RAD001），上機(jī)MinION flowcells（R9.0）,； ONT sequencing library （SQK-LSK108和SQK-RAD002）,，ONT MinION flowcell（R9.4）。 下機(jī)數(shù)據(jù)共15.6G（Table 2）,，k-mer分析預(yù)估基因組~860 Mb,，下機(jī)數(shù)據(jù)基本上是基因組18X測序深度。 Table 2 Nanopore測序 研究者開發(fā)組裝新工具TULIP（The Uncorrected Long-read Integration Process）,，在二代數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上組裝得到基因組891.7 Mb,，Contig N50為1.2M，相對已有短讀長組裝的基因組草圖提升顯著,。 |
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