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導讀 核糖體小亞基（英文：Ribosomal Small
Subunit，簡稱“SSU”）是核糖體中較小的核糖體亞基,。每個核糖體都由一個核糖體小亞基與一個核糖體大亞基共同構成,。小亞基核糖體RNA（SSU rRNA）基因，如細菌中的16S和真核生物的18S,，是微生物的分子“身份證”,，常用于微生物多樣性和分類等研究。傳統(tǒng)方法難以避免擴增引物偏倚性影響結果,，而對SSU
rRNA進行全長測序可以消除這種局限性,，更準確的鑒定微生物。1990年,，有研究報導能夠從復雜環(huán)境樣品中獲得的一些16S rRNA序列,，打開了研究地球上未知微生物世界的大門。近年來,，SSU rRNA 的測序常常用于微生物的研究,。SILVA數據庫中約有近200萬條的全長SSU序列。大多數全長的SSU序列都是通過PCR擴增,，測序拼接獲得的,，成本高。二代測序的得到的序列短,，雖然三代測序序列長,，但測序錯誤率高，通量低,，價格貴,。測序技術的缺陷、缺少好的通用引物等限制了研究者發(fā)現,、認識新的物種,。 本研究基于SSU共有的poly（A）合成cDNA，構建文庫進行測序,，分析7種環(huán)境樣本的微生物群落構成,。 本研究基于SSU共有的poly（A）合成cDNA,，構建文庫進行測序，分析7種環(huán)境樣本的微生物群落構成,。
原名：Retrieval
of a million high-quality, full-length microbial 16S and 18S rRNA gene
sequences without primer bias 譯名：基于16S和18S rRNA基因的全長無偏差測序研究微生物多樣性 期刊：Nature
biotechnology IF：41.667 發(fā)表時間：2018年 通訊作者：Mads Albertsen 作者單位：奧爾堡大學 1 測序方法的建立 1.1 DNA樣品準備 提取樣品中RNA,，采用凝膠電泳法選擇目標片段?；诤怂醦oly（A）合成單鏈cDNA,。依據模板合成雙鏈cDNA。 
圖1 cDNA合成過程 1.2 構建文庫測序 雙鏈DNA片段進行擴增,，采用凝膠電泳法進行純化,，純化后片段再次擴增，用于建立測序文庫(Read-tag library)與建立接頭文庫(Linked-taglibrary),。拼接測序片段,， PCR擴增，高通量測序獲取SSU序列,，利用inner引物擴增接頭文庫進行測序,。 
圖2 構建文庫測序 將具有相同接頭文庫的序列歸為一類，分為一類的基因序列進行拼接,，獲得SSU的全長序列,，進行物質注釋。 
圖3 數據分析 本研究獲得了61,266條古細菌全長16S序列,，比目前整個SILVA數據庫中的古細菌序列還多,。通過聚類之后，得到3,410個古細菌的OUT,；獲得了70,883條真核生物18S序列,，得到415個真菌的OTU。獲得的1,，168,，276 條LSU 序列，比目前整個SILVA數據庫的LSU序列還要多,。通過序列相似度比對細菌和古細菌數據庫,，發(fā)現了大量新的綱、目,、科等分類單元,。同時，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示幾個位于系統(tǒng)發(fā)育樹底部的古細菌與已知的任何古細菌分支聚在一起,，而是單獨聚成幾支,。
圖4 生命樹覆蓋率 本研究采用Escherichia coli MG 1655, Bacillus subtilis str. 168和 Pseudomonas aeruginosa PAO1 3種菌的混合群落，評估研究方法的錯誤率以及嵌合體數量。結果顯示,，在一個Illumina MiSeq Run 中,，平均的測序錯誤率為0.17%，嵌合體比例為0.4%,。測序錯誤率與PCR反應時的Taq酶的錯誤率基本一致,。嵌合體比例比傳統(tǒng)的基于PCR反應的方法低50倍。
圖5 古細菌覆蓋率 本研究通過多步驟優(yōu)化得到小亞基核糖體RNA（SSU rRNA）全長cDNA,，采用高通量方法獲得高質量,、無引物偏倚的SSU rRNA全長序列。建立方法分析不同環(huán)境中的微生物群落構成,。結果顯示,，該方法的錯誤率低，結果信息量大,，發(fā)現約50%的新物種,。通過與SILVA數據庫進行比對，發(fā)現了大約有58%的OTU與SILVA差異度大于97% ,，可見環(huán)境中還有大量的新物種未被人們發(fā)現。 本研究依據核糖體的全長對不同環(huán)境中的樣品進行研究,，該方法能夠有效擴充現有數據庫,，完善微生物的分類，促進人類對地球上未知微生物的認識,。 本文由李紅霞編譯,，李紅霞、江舜堯編輯,。
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