現(xiàn)今常用的制備慢病毒載體的方法為使用3或者4質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,。此外,，也有使用其它幾類慢病毒包裝細(xì)胞系制備慢病毒載體,。

瞬時轉(zhuǎn)染制備慢病毒：

細(xì)胞：慢病毒包裝常用人胚腎細(xì)胞(HEK, human embryonic kidney)293T,，其含有SV40病毒的大T抗原蛋白編碼基因，轉(zhuǎn)染效率極高,。但其貼壁性不好,，所以需要使用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿增加其吸附性。多聚賴氨酸培養(yǎng)皿可購買,，也可自行制備,。轉(zhuǎn)染前，細(xì)胞密度控制在40-70%比較好,。

DNA：每10 cm培養(yǎng)皿約含5x10⁶ 293T細(xì)胞,，需用30-40 ug不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒的純度對慢病毒載體的包裝效率非常關(guān)鍵,。不同的包膜蛋白表達(dá)載體,，其使用量也不同。

轉(zhuǎn)染：最經(jīng)濟(jì)的轉(zhuǎn)染方法是磷酸鈣轉(zhuǎn)染法,，雖然其溶液配置影響因素多,，不易穩(wěn)定重復(fù)得到最佳的轉(zhuǎn)染結(jié)果。其它方法有脂質(zhì)體法和PEI法,。轉(zhuǎn)染48-60后可以收集上清,，通過低速離心，然后濾膜過濾可以去除上清中的細(xì)胞碎片,。如果使用VSV-G包膜蛋白的話,，可以通過兩次超速離心進(jìn)行濃縮，從而最高可以獲得滴度高達(dá)10¹¹-10¹²IU/ml的慢病毒載體,。之后可以將病毒載體溶解在PBS,， HBSS或者DMEM中,，并置于-80⁰C儲存。儲存溶液添加血清會幫助提高病毒凍融時的存活率,，然而有些病毒在侵染細(xì)胞時,，血清會有干擾，所以需要依據(jù)具體病毒種類考慮是否添加血清,。

病毒滴度：含VSV-G的慢病毒載體,，其滴度在濃縮前一般為10⁷IU/ml，濃縮之后可以達(dá)到10⁹-10⁷IU/ml ,。含有熒光標(biāo)記或者其它報告基因的病毒載體,，可以通過梯度稀釋侵染HeLa或者293，NIH3T3細(xì)胞來確定其滴度,；不含報告基因的可通過測定病毒顆粒中相關(guān)病毒蛋白的活性或者含量來確定其滴度,，比如使用p24^gag的ELISA試劑盒。一般來說,，每4-60 x 10³個病毒載體含1ng p24^gag,。然而這種方法測出來的滴度并不準(zhǔn)確，不同的病毒載體類型,，不同的儲存方式,，都會導(dǎo)致p24^gag和病毒載體顆粒的比值變化較大。甚至是不同的實驗室測出來的都會有差異,。亦可使用PCR法測定滴度,，其引物設(shè)計針對病毒顆粒的通用cDNA區(qū)域，因此不受外源插入片段的影響,，也不需要反轉(zhuǎn)錄步驟,，而且可以用于所有慢病毒載體。

注意事項

 1,，避免使用小量抽提質(zhì)粒,，其純度相比中抽和大抽而來的質(zhì)粒純度較低，可能會降低包裝效率,。

2,，對于基于HIV-1的慢病毒載體而言，依實驗?zāi)康?，可能需要Vpr或者Rev輔助蛋白因子,。有些細(xì)胞類型需要這些輔助蛋白的參與才能達(dá)到高侵染效率。

3,，包裝細(xì)胞系的質(zhì)量對高效包裝病毒非常關(guān)鍵,。轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞密度在40-60%之間比較合適,，過低或者過高密度都可能會降低病毒包裝效率,。細(xì)胞開始出現(xiàn)匯合時,，需要及時更換或者添加新鮮培養(yǎng)基以保持細(xì)胞健康狀態(tài)。

4,，氯喹對細(xì)胞有毒性,，一般將標(biāo)準(zhǔn)使用濃度之下的氯喹與細(xì)胞共孵育的時間控制在8小時之內(nèi)?；蛘呓档吐揉氖褂脻舛?，延長孵育時間。

5,，病毒包裝時的細(xì)胞培養(yǎng)溫度需要綜合兩方面因素考慮：a),，37⁰C最有利于保持細(xì)胞健康狀態(tài)；b),，32⁰C最有利于維持重組病毒的穩(wěn)定性,。

6，收集病毒上清時的離心步驟可以去除細(xì)胞碎片以及少數(shù)懸浮的293T細(xì)胞,。必要時,，需要過濾以徹底去除一些細(xì)胞成分的污染。

7,，凍融會降低病毒侵染效率50%,，因此需要避免多次反復(fù)凍融。病毒放置于4⁰C時每36-48小時侵染效率下降50%,。

8，視實驗?zāi)康亩?，為降低血清成分污染,，建議使用低濃度血清培養(yǎng)基。

9,，通過使用0.45mm的濾膜不僅可以去除細(xì)胞碎片殘留,，還可以去除VSV-G殘留片段對細(xì)胞的毒性影響，但同時也會部分影響病毒滴度,，所以過濾步驟需要依據(jù)具體實驗?zāi)康亩ā?/p>

10,，使用TNE重懸病毒沉淀時，雖然低體積會增加病毒濃度,，然而由于VSV-G介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的融合,，所以高濃度VSV-G對細(xì)胞會造成一定毒性，而有些細(xì)胞對VSV-G引起的毒性比較敏感,，因此最終體積需要依據(jù)具體實驗而定,。

11，超離心純化病毒步驟可以重復(fù)二次,，第二次可以使用培養(yǎng)基而不是TNE溶液重懸病毒,。

12,，使用病毒載體侵染細(xì)胞時，細(xì)胞密度對侵染效率有較大影響,。細(xì)胞匯合密度過高會降低侵染效率,。

13，侵染所使用的病毒載體體積和病毒滴度,，病毒載體的質(zhì)量以及靶細(xì)胞種類有關(guān),。

14，使用polybrene之后,，需要更換新鮮培養(yǎng)基,，因為polybrene對細(xì)胞有毒性作用。少數(shù)細(xì)胞會特別敏感,，因此不同細(xì)胞polybrene的最佳作用濃度和時間都有所不一樣,。

15，針對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的病毒載體侵染,，建議使用Spin Infection方法,，此法對于侵染效率低的貼壁細(xì)胞同樣有幫助。

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