// 2022 WINTER

目前用于轉(zhuǎn)染的病毒載體包括γ逆轉(zhuǎn)錄病毒,，慢病毒，腺病毒等,，其中γ逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒,，能夠?qū)⒒蚪MRNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，并且整合到宿主基因組中,，從而達(dá)到目的基因穩(wěn)定表達(dá)的目的,。慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建主要分為病毒包裝和慢病毒感染細(xì)胞兩個(gè)部分。

實(shí)驗(yàn)操作基本流程（以第三代慢病毒載體為準(zhǔn)）

一,、病毒包裝

1.     構(gòu)建四種質(zhì)粒

包裝質(zhì)粒（攜帶gag基因和pol基因）

質(zhì)粒（攜帶env或VSV-G基因）

質(zhì)粒（攜帶rev基因）

載體質(zhì)粒（攜帶LTR,，ψ，RRE和包含內(nèi)部啟動(dòng)子的目的基因）

2.     準(zhǔn)備HEK293T細(xì)胞（工具細(xì)胞）

3.     通過瞬轉(zhuǎn)方式（比如脂質(zhì)運(yùn)載體,，磷酸鈣沉淀法等）使四種質(zhì)粒進(jìn)入HEK293T細(xì)胞中

4.     在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)收集病毒上清液（可直接感染或濃縮后感染）

二,、慢病毒感染細(xì)胞

1.     向細(xì)胞中加入病毒液

2.     抗生素篩選出穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞系

實(shí)驗(yàn)操作基本原理

一、 HIV病毒

HIV病毒包括RNA基因組和蛋白成分,?；蚪M可以編碼九種病毒蛋白；基因組兩側(cè)是長(zhǎng)末端重復(fù)序列（Long Terminal Repeats, LTR）,，主要由U3（啟動(dòng)子）,，R（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)）和U5（逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)位點(diǎn)）組成，是病毒逆轉(zhuǎn)錄,，整合和轉(zhuǎn)錄所需的順式作用元件,；在LTR和蛋白翻譯基因之間有“ψ”和RRE，“ψ”作為基因組二聚化和包裝信號(hào),；RRE促進(jìn)病毒基因組有效運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中進(jìn)行高效包裝。HIV病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中,，通過逆轉(zhuǎn)錄酶將LTR之間的序列逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA,，然后通過整合酶將雙鏈DNA整合到宿主基因組中。5’LTR傾向于將基因組整合到宿主基因組轉(zhuǎn)錄比較活躍的位點(diǎn),，3’LTR介導(dǎo)RNA 3’端多聚腺苷酸的形成,，以穩(wěn)定RNA序列。

二,、 慢病毒載體

人為構(gòu)建載體質(zhì)粒,，將LTR序列之間的病毒基因組替換成目的基因，利用HIV病毒的逆轉(zhuǎn)錄和整合功能將目的基因插入宿主基因組中。由于病毒基因組被替換掉,，因此需要其他質(zhì)粒來表達(dá)病毒實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄,，整合和轉(zhuǎn)錄等功能所需的功能蛋白，即包裝質(zhì)粒（攜帶gag基因和pol基因）,，質(zhì)粒（攜帶env或VSV-G基因）和質(zhì)粒（攜帶rev基因）,；質(zhì)粒所攜帶的基因功能如表1所示。其中env基因一般替換成VSV-G基因,，主要是因?yàn)閑nv蛋白只能與CD4受體結(jié)合,，而VSV-G具有廣泛親嗜性，可以與多數(shù)細(xì)胞表面分子結(jié)合,，擴(kuò)大了慢病毒感染細(xì)胞類型,，同時(shí)可以提高病毒顆粒的穩(wěn)定性，尤其是高速離心過程中病毒顆粒的穩(wěn)定,。

1.      病毒包裝

這一過程是在HEK293T細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)的,。

質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞核中，在細(xì)胞核中完成轉(zhuǎn)錄,，在細(xì)胞質(zhì)中完成翻譯,，包裝質(zhì)粒（攜帶gag基因和pol基因）用于合成病毒的基質(zhì)蛋白，衣殼蛋白和核衣殼蛋白等核心蛋白成分（gag基因編碼蛋白）以及蛋白酶,，逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶等（pol基因編碼蛋白）,；質(zhì)粒（攜帶env或VSV-G基因）用于合成蛋白的外膜蛋白（env/vsv-g編碼蛋白），用于病毒融合并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),；質(zhì)粒（攜帶rev基因）用于合成rev蛋白,；載體質(zhì)粒（攜帶LTR，ψ,，RRE,，包含內(nèi)部啟動(dòng)子的目的基因）用于轉(zhuǎn)錄出病毒的RNA基因組，包括LTR,，ψ,，RRE和目的基因的mRNA序列。RRE促進(jìn)病毒基因組運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中實(shí)現(xiàn)高效包裝的,；ψ為包裝信號(hào),，引起病毒的包裝；最終包裝的病毒顆粒中有RNA基因組和功能蛋白（gag,，pol,，env/vsv-g，rev）,。

此外第三代使用強(qiáng)異源啟動(dòng)子替代5’LTR的U3啟動(dòng)子,，可以顯著提高病毒RNA基因組的轉(zhuǎn)錄，從而增加病毒滴度。最終從上清液中獲取包裝好的病毒顆粒,。雖然病毒包裝這一步的完成暫且不需要整合功能,，但病毒基因組難以避免的會(huì)整合到HEK293T細(xì)胞基因組中，因此完成病毒包裝的HEK293T細(xì)胞會(huì)被丟棄,。

2.      慢病毒感染細(xì)胞

使用病毒上清液（病毒顆粒）感染目的細(xì)胞,，只有一次感染能力，而無復(fù)制能力,，外膜蛋白協(xié)助病毒進(jìn)入細(xì)胞中,，同時(shí)完成病毒脫殼，病毒顆粒中的RNA基因組和蛋白成分分散在目的細(xì)胞質(zhì)中,。RNA基因組在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過程,，生成雙鏈DNA（前病毒DNA），由逆轉(zhuǎn)錄酶,，整合酶,，VPR，基質(zhì)蛋白和前病毒DNA組成前整合復(fù)合物,，穿過核孔（而γ逆轉(zhuǎn)錄病毒只能在核膜溶解的情況下進(jìn)入細(xì)胞核中,，因此只能感染分裂細(xì)胞），進(jìn)入細(xì)胞核中,。在整合酶的作用下,，前整合DNA被整合到宿主基因組中，整合進(jìn)去的目的基因的表達(dá)由內(nèi)部的強(qiáng)異源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng),，而非U3,，因?yàn)閁3屬于弱啟動(dòng)子，需要tat激活才能放大效應(yīng),，而我們構(gòu)建的慢病毒載體中沒有tat基因,。此外，第三代使用SIN（自我滅活）替代3’LTR的U3結(jié)構(gòu),，逆轉(zhuǎn)錄使SIN成為前病毒DNA（即整合到宿主基因組的載體序列） 5’LTR的啟動(dòng)子,，從而喪失從此部位啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的活性。

3.      其他優(yōu)化元件

cPPT：增加病毒基因組的核輸入,，提高載體序列整合到宿主基因組的效率

WPRE：增強(qiáng)病毒RNA在包裝病毒的穩(wěn)定性,，增加病毒包裝效率

輔助基因：在第二代慢病毒載體中被刪除

4.      HEK293T作為工具細(xì)胞的原因

其一，HEK293T細(xì)胞中有SV40T抗原,，可以增加載體質(zhì)粒sv40 ori（復(fù)制）的活性,，有效增加病毒滴度,。

其二,，HEK293細(xì)胞增值能力和轉(zhuǎn)染效率高。