慢病毒技術(shù)

慢病毒（Lentivirus）是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種,。慢病毒載體（Lentiviral vector）是在人類免疫缺陷I型病毒(HIV-1)基礎(chǔ)上改造而成的,，能利用逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶,，將自身的RNA轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA整合到宿主細(xì)胞的染色體中,，從而使目的基因在宿主細(xì)胞中長期而穩(wěn)定的表達(dá),。 在研究RNAi方面,，慢病毒技術(shù)是最為有效的一種解決方案。

實驗步驟

前期準(zhǔn)備：

1.構(gòu)建含有目的基因的病毒載體,。2.指數(shù)生長的293T細(xì)胞,；3.病毒包裝質(zhì)粒Mix=pMDL:VSVG:REV=5:3:2，不同載體系統(tǒng)所用的包裝病毒質(zhì)粒也不一樣,，此系統(tǒng)可用于包裝PLKO,，Plv等載體質(zhì)粒。4.轉(zhuǎn)染試劑：lipo2000,。

1.細(xì)胞分盤

通過胰酶消化收集細(xì)胞,，用適當(dāng)?shù)耐耆囵B(yǎng)基平鋪細(xì)胞于35mm 培養(yǎng)皿上（根據(jù)實驗需要選擇培養(yǎng)皿，使細(xì)胞貼壁后所占面積達(dá)到培養(yǎng)皿總面積的80％以上）,。將細(xì)胞置于含5％CO2的37℃溫箱中孵育8-24h,當(dāng)細(xì)胞貼壁完全后即可開始轉(zhuǎn)染,。轉(zhuǎn)染前 2h 換液（用1.5ml 完全培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基）。

2.混勻核心質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒

取無菌1.5ml EP管,，加入400μl 無血清DMEM,，加入1.5μg 核心質(zhì)粒和1.5μg 病毒包裝質(zhì)粒，及6μl turbofect (turbofect ：質(zhì)粒＝2:1）,，充分混勻,，靜置15-20min。

3.孵育

將這400μl 的混合液逐滴加入上述單層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中,，輕輕搖動平皿混勻后置于含5％CO2的37℃溫箱孵育,。

4.收集病毒上清

6-10 h后吸去培養(yǎng)基，加入2.5ml37℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基,，繼續(xù)將細(xì)胞放置溫箱孵育,，40h左右可以收集含慢病毒的上清進行感染或者分裝后置于－80℃儲存待用。（1500rpm離心五分鐘,，一般可收集到2ml 含病毒上清）

5.病毒感染

1）將細(xì)胞平鋪于6孔板或12孔板,，最佳密度為30%－70％。

2）對于六孔板：（12孔板減半）

Infectmouse cells：800-1600μl virus + 1600-800 μl fresh medium =2.4 ml total

Infecthuman cells：200-800μl virus + 1200 μl-800 μl fresh medium =2 ml total

3）加入2-5μg/ml polybrene, 充分搖勻后置于37℃溫箱孵育,。

4）12-24h 后換液,，長滿后傳代或者檢測表達(dá)，做實驗,。

常見問題

Q1. 怎樣購買份量合適數(shù)量的慢病毒顆粒,？

一套完整實驗所需的慢病毒顆粒包括：1. 含有目的基因的慢病毒顆粒，2. 陰性對照慢病毒顆粒,，3. 用于預(yù)實驗的陽性對照慢病毒顆粒,。

購買時可以根據(jù)目的細(xì)胞特性、檢測方法,、培養(yǎng)器皿估算慢病毒顆粒的最佳用量,，避免剩余的大量慢病毒顆粒超出最佳保存期；此外,，GeneCopoeiaTM 同時提供高滴度低價格的陽性對照慢病毒顆粒,，幫助您以較低的預(yù)算和較充足的材料完成預(yù)實驗的條件探索。初次使用慢病毒顆粒的研究者也可使用陽性對照慢病毒顆粒熟悉實驗過程,。

Q2. 慢病毒顆?？梢杂糜趧游矬w內(nèi)（In vivo）實驗嗎？GeneCopoeiaTM 提供的即用型慢病毒顆粒全部經(jīng)過純化,、濃縮處理,，去除了細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，進一步降低免疫原性,，適用于各類活體動物注射實驗和成瘤實驗,。

Q3. 慢病毒顆粒對目的細(xì)胞的感染效率很低，如何提高感染效率,？提高感染效率的前提是保證細(xì)胞生長狀態(tài)良好,。其次，可以通過提高 MOI 值來提高感染效率,，也可以在培養(yǎng)基中加入 Polybrene (4-10 μg/mL) 提高感染效率,。

Q4. 添加慢病毒顆粒后，細(xì)胞為什么大量死亡?慢病毒顆粒對靶細(xì)胞有一定毒性,。添加量過多,、感染時間過長都可能對目的細(xì)胞 造成傷害,。如遇上這種情況，建議您降低 MOI 值,，并在感染細(xì)胞 4-8 小時后進行換 液（以新鮮的全培養(yǎng)基替換含慢病毒顆粒的舊培養(yǎng)基）,，最長換液時間不可大于 12 小時。

Q5.Polybrene 是什么,？在慢病毒顆粒感染中,，Polybrene 添加越多越好嗎？Polybrene 是常用的感染添加劑,，通常的使用濃度為 4-10 μg/mL,，Polybrene 能 顯著提高慢病毒的感染效率，通常能提高感染效率 2-10 倍,，對部分細(xì)胞甚至可 提高感染效率 10-20 倍,。當(dāng)目的細(xì)胞 MOI 高于 20 時，我們建議在培養(yǎng)基中加入 Ploybrene(約 4-10 μg/mL) 適當(dāng)提高感染效率,。在正式使用 Polybrene 前,，建議在 1-10 μg/mL 范圍內(nèi)設(shè)置梯度，觀察細(xì)胞在該濃度下,，24 小時后是否仍保持健康生長,，從而確定該細(xì)胞的最適 Polybrene 濃度。

Q6. 目的細(xì)胞可以被慢病毒顆粒感染,，但 eGFP 的熒光強度很低,，為什么？在目的細(xì)胞被慢病毒顆粒感染過程中,，eGFP 熒光強度取決于病毒感染細(xì)胞內(nèi)的慢病毒顆粒數(shù),、細(xì)胞本身的狀態(tài)、細(xì)胞類型以及觀察時間等,。一般情況下,，目的細(xì)胞感染慢病毒顆粒數(shù)越多，細(xì)胞增殖越快,，eGFP 熒光會較強,。慢病毒攜帶基因表達(dá)時間較長，一般在增殖較快的細(xì)胞中也需要感染 72-96 小時才會到達(dá) eGFP 的表達(dá)高峰,。對于增殖較慢的細(xì)胞,，感染時間則需更長。建議如果您的細(xì)胞在感染后觀察的熒光強度較低,，建議繼續(xù)培養(yǎng)一段時間再觀察,。

Q7. 進行慢病毒顆粒感染后，為什么目的細(xì)胞用 qPCR 檢測不到目的基因表達(dá)量的變化？如果使用的檢測方法是 qPCR,，原因可能是目的基因含特殊序列結(jié)構(gòu),、或與目的細(xì)胞系統(tǒng)不能兼容的問題，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受影響,，建議同時培養(yǎng),、感染目的細(xì)胞和 293T 工具細(xì)胞，同時進行檢測,，如目的基因在 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄不受影響，則可能為目的基因與目的細(xì)胞的相互作用導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受阻,。

Q8. 慢病毒顆粒在儲存期間不慎染菌,，還可以繼續(xù)使用嗎？如慢病毒顆粒不慎染菌,，且實驗材料有限,，可以使用 0.45 μm 濾膜對慢病毒進行濾菌操作。當(dāng)然,，該操作會導(dǎo)致一定程度的滴度損失及慢病毒顆?？偭繐p失。如條件允許,，建議重新購買該種慢病毒。

東澳服務(wù)

產(chǎn)品特點

樣本廣泛：可以感染各類細(xì)胞,，包括神經(jīng)元、間充質(zhì)干細(xì)胞,、神經(jīng)干細(xì)胞等,，對活體動物也可以進行感染,。

輕松感染：利用高滴度的慢病毒，可以輕松感染各類細(xì)胞,，重復(fù)性好,，并且較容易獲取穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,。

低毒高效：由于利用生物方式進行轉(zhuǎn)基因，對細(xì)胞傷害較低,，大大提高了實驗對象的成活率,，并且再感染效率高。

個性服務(wù)：可以根據(jù)客戶需求,，構(gòu)建干擾載體，表達(dá)載體,，熒光標(biāo)記載體,，一切本著以人為本的服務(wù)理念。

應(yīng)用范圍

本產(chǎn)品適用于多種基因水平的操作,，如RNA干擾，表達(dá)基因及活體熒光標(biāo)記等,。

實驗流程

示例