慢病毒載體系統(tǒng)基于人類免疫缺陷Ⅰ型（HIV-1）病毒改造的，這是一種經(jīng)過充分研究的人類病原體病毒,。目前廣泛應用于科研及臨床研究的慢病毒四質(zhì)粒包裝系統(tǒng),，屬于第三代慢病毒包裝系統(tǒng)，由1個包含目的基因的表達質(zhì)粒,、2個包裝質(zhì)粒,、1個包膜蛋白質(zhì)粒組成。

包裝質(zhì)粒中含有包裝,、逆轉(zhuǎn)錄及整合所需的順式序列（RRE,，ψ,，LTRs），及目的基因或標記基因（綠色熒光蛋白GFP）,。其中1個包裝質(zhì)粒包含Gag和Pol基因,，Gag編碼核心蛋白（基質(zhì)蛋白、衣殼蛋白,、核衣殼蛋白）,，Pol基因編碼前體蛋白，經(jīng)切割形成反轉(zhuǎn)錄酶,、整合酶,、蛋白酶，另1個包裝質(zhì)粒包含REV基因,，其編碼的Rev蛋白與慢病毒基因組中的RRE結(jié)合,，將基因組mRNA從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中。

包膜蛋白質(zhì)粒使用水皰性口炎病毒糖蛋白G基因（VSV-G）來替代原病毒的env基因,，應用VSV-G包膜的假構(gòu)型慢病毒載體擴大了載體的靶細胞嗜性范圍,，同時也增加了載體的穩(wěn)定性。

基因組mRNA與衣殼蛋白,、包膜蛋白等組裝成假病毒顆粒,。四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)，極大地降低了產(chǎn)生具有復制能力慢病毒的可能性,，而VSV-G蛋白的使用也降低了這種重組的可能性,。

圖1. 第三代慢病毒的4質(zhì)粒系統(tǒng)^[1]。

利用慢病毒載體,，可以穩(wěn)定地過表達特定基因,、研究啟動子的調(diào)控機制、或利用RNA干擾技術(shù)來沉默特定基因的表達等,。慢病毒表達載體包含了包裝,、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息,。為了提高轉(zhuǎn)染細胞的效率,，需要獲得高滴度的病毒顆粒，這和包裝用的細胞狀態(tài),、目的基因的大小,、質(zhì)粒質(zhì)量和收毒時機有關(guān)。包裝好的病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中,，離心取得上清液后,，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因遞送到宿主細胞之后，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄整合到宿主細胞基因組中,，從而高水平地表達相應的蛋白,。

根據(jù)不同的實驗目的，可以選擇相應的慢病毒載體,，例如：

? 常規(guī)功能基因過表達/干擾慢病毒

? 非編碼miRNA/lncRNA/circRNA慢病毒

? 基因敲除慢病毒

此外,，也可以選擇不同的啟動子、篩選標記,、表達標簽或者報告基因等,，滿足個性化的研究需要。

圖2. 慢病毒包裝技術(shù)路線,。

靜息狀態(tài)是免疫系統(tǒng)的一個獨特特征,，T淋巴細胞可以長時間保持不分裂狀態(tài)^[3]。血液中的大多數(shù)循環(huán)T細胞處于靜息狀態(tài),，其特點是代謝率低,、轉(zhuǎn)錄水平低、體積小和生存期非常長^[4],。

在Zack等人對HIV病毒的研究中^[3],，詳細介紹了HIV病毒感染靜息狀態(tài)下T細胞的局限性。首先是靜息T細胞中HIV的預整合受到抑制,，和激活的T細胞相比,，病毒的感染能力不變，但是逆轉(zhuǎn)錄存在明顯差異,，比如逆轉(zhuǎn)錄速度較慢,、病毒cDNA不穩(wěn)定等。其次,，在靜息T細胞中HIV表達存在缺陷,，包括LTR缺陷,、基因整合到轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域,。

已有多項研究表明，包括親本病毒HIV-1及其衍生載體在內(nèi)的病毒系統(tǒng)可以進入靜息狀態(tài)下的T淋巴細胞,，但不會復制^[5],。主要包括：

1.逆轉(zhuǎn)錄的啟動以及完成過程中存在缺陷

2.缺乏ATP依賴的核輸入

3.缺乏前期病毒基因組的整合

基于HIV的慢病毒載體系統(tǒng)在靜息T細胞中的轉(zhuǎn)染仍有難度。因此在轉(zhuǎn)染前需要對T細胞進行激活,。例如,，通過T細胞受體和 CD28 共刺激受體的刺激，使用抗CD3 ,、抗CD28抗體,，誘導靜息T細胞進入細胞周期的 G1b期，可以使細胞易受HIV-1感染和復制^[6]?；蛘邔細胞暴露于不觸發(fā)細胞分裂的細胞因子也可以使HIV-1載體完成轉(zhuǎn)導^[7],。

圖3. 慢病毒轉(zhuǎn)染T細胞案例。上：PBMC活化擴增第十天T細胞占比及表型分析實驗結(jié)果,。下：FMC63 CAR-T細胞CAR陽性率檢測結(jié)果,。

Leber 先天性黑蒙 （LCA16）是一種遺傳性兒科失明，由KCNJ13基因的致病變異引起,。KCNJ13基因編碼一種結(jié)構(gòu)為四聚體的 Kir7.1 亞基,，該亞基在視網(wǎng)膜色素上皮 （RPE） 中內(nèi)向整流鉀離子通道，維持離子穩(wěn)態(tài)并且使光感受器能夠編碼視覺信息,。

在Pawan K. Shahi等人的研究中^[8],，驗證了KCNJ13基因與Kir7.1通道的作用機制。首先,，該研究組獲得了KCNJ13基因缺陷的人類誘導多能干細胞（hiPSC）-RPE細胞,，并驗證了該細胞具有正常形態(tài)但不表達功能性Kir7.1通道，因此不具備生理活性,。為了探究KCNJ13基因?qū)ir7.1亞基表達的影響,，該研究組使用了慢病毒pLV-EF1α Kir7.1-GFP，成功地將KCNJ13基因遞送至hiPSC-RPE細胞,，并且恢復了Kir7.1通道功能,。第三代慢病毒包裝系統(tǒng)降低了產(chǎn)生可復制病毒的風險，在轉(zhuǎn)導有絲分裂后RPE細胞中的效率更高,。

圖4. 使用慢病毒轉(zhuǎn)染后,，hiPSC-RPE 細胞膜電位恢復正常^[8]。A-C：慢病毒遞送基因后膜電位恢復,；D：免疫印跡分析,；E：使用慢病毒轉(zhuǎn)染后，hiPSC-RPE成功表達Kir7.1（綠色）,。