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在高中《生物》的實驗教學中,，“葉綠體中色素的提取與分離”實驗既比較復雜又非常重要。其中提取綠色葉片中的色素是這一實驗中最關鍵的步驟,。色素提取液的質量直接影響到分離效果的好壞乃至整個實驗的成敗?！渡飳W教學》近幾期刊登了幾位作者對這一步驟的改進,，筆者通過實驗，對實驗原理提出了新的見解,，并據此對實驗方法進行了改進,。
一、關于丙酮的用量
教材要求研磨時加2毫升丙酮,，由于丙酮揮發(fā)性太強,，研磨后只能形成糊狀物，難以過濾出濾液,。經過實驗,，將丙酮的用量提高到7～10毫升較好。
二,、關于碳酸鈣的作用
葉綠素是一種含鎂的化合物,，其中的鎂易被H-、Cu2+,、Zn2-等取代,。當被H-取代后，就形成去鎂葉綠素,，呈黃褐色,。雖然研磨過程中不發(fā)生產生大量H+的化學反應，但液泡中常含有多種有機酸,。一般認為,，碳酸鈣的作用在于中和研磨過程中產生的H+,，以防止葉綠素被破壞。實驗證明,，不加碳酸鈣研磨產生的色素提取液與相同條件下加碳酸鈣研磨產生的色素提取液顏色相差無幾,，可見色素的損失并不大。但將提取液加塞后在暗處放置幾小時,，前者變黃而后者無顯著變化,，說明前者葉色素容易遭到破壞、證明碳酸鈣確能防止色素的破壞,。
三,、關于研磨的問題
教材要求“迅速充分地研磨”?！把杆佟碑斎皇菫榱丝s短研磨時間,，以減少丙酮的揮發(fā)?！俺浞帧币_到什么程度呢,？實驗證明，用5克綠葉加10毫升丙酮及少許二氧化硅和碳酸鈣,，迅速研磨1分鐘左右,，此時葉片未被研細，尚有很多葉片呈碎片狀,，顯然研磨并不充分(本文姑且稱這種研磨程度為“研磨適當”),，但過濾后能得到濃綠的色素提取液。用這種提取液在濾紙條上重復劃線8次后分離,，色帶仍較淡,，說明這種色素提取液濃度還是小。
實驗時常有一些學生為了“研磨充分”而出現研磨時間過長的問題,。這時所有的葉片均被研細,，與丙酮混合成糊狀勻漿(本文姑且稱這種研磨程度為“研磨過度”，實際上恰是“研磨充分”),。這時無論研磨前是否加碳酸鈣,，濾液均呈黃色。這樣的濾液無法用于分離實驗,。顯然,，“迅速”和“充分”在這里發(fā)生了矛盾?！把杆佟眲t不充分,，“充分”濾液卻呈黃色。對這一現象的解釋,，一種流行的觀點認為研磨時間過長使色素遭到破壞造成了濾液呈黃色,。但細心觀察就會發(fā)現,，這時的濾渣仍為濃綠色。將濾渣倒回研缽,，再加5毫升丙酮,，攪拌均勻后進行二次過濾。結果無論研磨前是否加了碳酸鈣,，濾液均呈極濃的綠色,，在0.5厘米內徑的小試管中幾乎不透明，比研磨適當時得到的色素提取液要濃得多,。這種提取液用于分離,，效果很好?？梢?，色素并沒有因研磨時間過長而被破壞，研磨時間過長時濾液呈黃色是因為色素被吸附到濾渣中,，沒能進入濾液,。
是什么原因造成了這種吸附呢？取上述研磨過度時的濾渣(色素均吸附在其中)3毫升左右放入試管中,，再加入2毫升丙酮,，振蕩均勻后靜置，幾分鐘后出現極濃綠的澄清液,，說明色素被提取出來了。然后問試管中逐滴滴入清水,，每滴5滴振蕩均勻后靜置,，觀察顏色變化，發(fā)現滴入水量越多,，澄清液顏色越淺,，同時濾渣顏色越深。5～6次后(已滴入1～1.5毫升水),，澄清液呈淺黃綠色,，色素又重新被吸附到濾渣中。將這些淺黃綠色的澄清液(主要是水和丙酮的混合物)倒出,，向試管中的沉淀渣中再加2毫升丙酮,，振蕩后靜置，澄清液再次呈濃綠色,，如此可反復進行,。可見,，色素能否被提取出來,，關鍵在于提取液中丙酮與水的比例,。這實質上是一個溶解問題。若含水多,，由于這些色素均不溶于水,，則色素被吸附在濾渣中，濾液呈黃色,；若含丙酮多,，則色素溶解進入濾液，濾液呈綠色,。5克新鮮菠菜葉中含有相當數量的水,，當加入的丙酮量一定時，研磨時間越長,，丙酮揮發(fā)越多,，研磨液中剩余的丙酮比例就越小，提取出的色素也就越少,，以致呈黃色,。
如果用干燥劑對色素提取液進行吸水處理，效果如何呢,？將研磨適當的提取液加3～5克無水硫酸鈉后再過濾,，所得濾液比加硫酸鈉前的提取液顏色稍深。但從實驗結果來看,，這種提取后去除水的方法濾液損失多,，且效果并不很顯著，同時增加了實驗步驟和藥品消耗,，使實驗復雜化,，不宜采用。
用研磨適當時產生的濾渣加5毫升丙酮二次提取,。結果這第二次濾液比第一次濾液色澤還濃綠,，說明濾渣中仍有大量色素。但這研磨適當時的二次濾液比研磨過度時的二次提取液還是淡得多,，這是因為第一次過濾時已有一部分色素進入了濾液,，而更重要的是因為研磨不充分，色素難以從葉綠體中提取出來,。
怎樣才能既利用了研磨充分時細胞結構得到充分破壞使色素易于提取這一優(yōu)點,，同時又提高提取液中丙酮的比例呢？經過反復實驗,，筆者進行了如下改進：采用室內預先陰晾半天的葉片3克(經測定,，新鮮時重5克以上，即減少水2克以上),，加3毫升丙酮及少許二氧化硅和碳酸鈣,，將葉片充分研細,，再加入5毫升丙酮，攪拌均勻后過濾,。所得提取液色素雖不如研磨過度時濾渣二次提取液濃,，但比研磨適當時的提取液濃得多。若研磨后直接過濾,，再用5～7毫升丙酮分2～3次洗滌濾渣,，所得提取液更濃，只是操作稍復雜一點,。
這一改進提高了色素提取液的濃度,，減少了劃線重復次數，提高了分離后色素帶的清晰度,，同時又不需二次過濾,，是一種較好的實驗方案。采用這一方案后,，學生實驗的成功率基本上達到100％,，且分離效果良好。
呂維棟,，生物學教學,，1996年第1期
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