細(xì)胞過(guò)度融合會(huì)引起代謝減慢、分裂減少以及接觸性生長(zhǎng)抑制,，進(jìn)而可能導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量與藥物作用之間失去線性關(guān)系,。因此,，控制實(shí)驗(yàn)起始時(shí)活細(xì)胞數(shù)量對(duì)于實(shí)驗(yàn)成功進(jìn)行至關(guān)重要,。臺(tái)盼藍(lán)拒染是選擇性區(qū)分活死細(xì)胞最常用的方法。染料帶負(fù)電,，只能在細(xì)胞膜被破壞（死亡細(xì)胞膜通透性增加）時(shí)才能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行著色,，健康細(xì)胞無(wú)色。但是該方法無(wú)法區(qū)分功能正常/喪失的活細(xì)胞,。測(cè)定方法：含0.4%（w/v）臺(tái)盼藍(lán)的PBS（pH 7.2）溶液20 μL與經(jīng)/未經(jīng)處理的巨噬細(xì)胞懸液20 μL混合,，取10 μL加至計(jì)數(shù)板和蓋玻片空隙中，5 min內(nèi)進(jìn)行計(jì)數(shù),，計(jì)算細(xì)胞存活率,。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞存活率至少為95%，可用于后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),。

人們于1983年首次描述了MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，該方法基于活細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能夠還原黃色水溶性MTT生成深藍(lán)色或紫色不溶性的formazan。方法的局限性在于最終產(chǎn)品formazan晶體會(huì)損傷細(xì)胞,，需要用有機(jī)溶劑（DMSO或HCl/異丙醇）進(jìn)行溶解,。結(jié)果測(cè)定時(shí),，向每個(gè)孔中加入20 μL MTT溶液（培養(yǎng)基或PBS配制：5 mg/mL）,，使最終濃度為0.5 mg/mL。37°C培養(yǎng)4 h后,，棄上清液并加入150 μL DMSO充分振搖溶解,，測(cè)定570 nm處的吸光度值?；蛘?，可以加入50 μL MTT終止液（三聯(lián)溶解液：SDS 10 g 異丁醇 5 mL 10 M HCl 0.1 mL用雙蒸水溶解配成100 mL溶液）代替DMSO，過(guò)夜培養(yǎng)24 h后,，使用微孔板讀取器測(cè)定570 nm處吸光度值,。

MTS也稱為歐文試劑，是一種與MTT密切相關(guān)的弱酸性內(nèi)鹽,，毒性相對(duì)較小,，帶負(fù)電，不易穿透細(xì)胞膜,。因此,，該試劑通常與電子耦合試劑吩嗪硫酸甲酯（PMS）或吩嗪乙基硫酸酯（PES）結(jié)合使用。這些中間產(chǎn)物可離開(kāi)細(xì)胞并將MTS轉(zhuǎn)化為在培養(yǎng)基中高度可溶的formazan產(chǎn)物,，并且這種轉(zhuǎn)化依賴于代謝活躍細(xì)胞中的NADP（H）脫氫酶,。通常，在每個(gè)孔中加入20 μL含MTS的PES試劑,，最終濃度為0.33 mg/mL,，孵育2 h后，使用微孔板讀取器測(cè)定490–500 nm處的吸光度,。

WST-1是一種帶負(fù)電的二磺化內(nèi)鹽,，含有碘殘基，在NADH和電子耦合體存在下,，可在細(xì)胞外產(chǎn)生高度水溶性formazan,。與傳統(tǒng)的四氮唑鹽相比，WST-1及其formazan在溶液中非常穩(wěn)定,，并且細(xì)胞毒性極低,。迄今為止，WST系列中已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種其他四唑鹽,，其中最有用的可能是WST-8,，即CCK-8,。由于WST-8、formazan產(chǎn)品和PMS在細(xì)胞培養(yǎng)基中沒(méi)有細(xì)胞毒性,，因此檢測(cè)結(jié)束后細(xì)胞還可用于其它實(shí)驗(yàn)（但一般不推薦繼續(xù)使用,，除非細(xì)胞極難獲得）。通常,，將20 μL WST-1或10 μL CCK-8添加到每個(gè)孔200 μL反應(yīng)體系中,，并在37°C培養(yǎng)4 h后測(cè)定450 nm的吸光度值。

XTT含有兩個(gè)磺酸基團(tuán),，帶負(fù)電,，無(wú)法自由穿透細(xì)胞膜。在電子耦合試劑存在的情況下,，XTT能夠被線粒體內(nèi)的一些與輔酶Ⅱ相關(guān)的脫氫酶還原生成水溶性的橘黃色formazan,，生成的formazan量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，并且formazan能夠溶解在組織培養(yǎng)基中,，不形成顆粒,，可直接用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值。

Alamar Blue的活性成分resazurin （刃天青）是一種無(wú)毒,、可透膜的藍(lán)色染料,，有微弱的熒光性，它作為一種氧化還原指示劑,，被細(xì)胞內(nèi)吞后,，在細(xì)胞質(zhì)中被以上這些代謝中間體還原，其還原產(chǎn)物resorufin呈現(xiàn)出粉紅色并有很強(qiáng)的熒光性,，最后可用普通分光光度計(jì)或熒光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè),，吸光度和熒光強(qiáng)度與活性細(xì)胞數(shù)成正比，因而可作為細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性定量檢測(cè)的一個(gè)理想的指示器,。Alamar Blue 細(xì)胞活力試劑具有廣泛的適用性,，可用于各種人和動(dòng)物細(xì)胞系、細(xì)菌,、植物和真菌的細(xì)胞活力檢測(cè),。

結(jié)晶紫染色最初用于單層培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè),，是一種簡(jiǎn)單的非酶測(cè)定法,，用于快速分析具有活性的粘附細(xì)胞及菌落數(shù)量,。該方法基于結(jié)晶紫染料與DNA雙螺旋外表面之間的親和力。缺點(diǎn)在于，結(jié)晶紫也能對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行非特異性染色,。測(cè)定方法：經(jīng)/未經(jīng)處理后的巨噬細(xì)胞用PBS洗滌后在37°C下與含有2%（v/v）乙醇-0.2%（w/v）結(jié)晶紫的PBS溶液孵育30 min,。孵育結(jié)束后用PBS洗滌,，以33%（v/w）乙酸溶解結(jié)晶紫，使用微孔板讀取器測(cè)定540 nm處的吸光度值,。

將巨噬細(xì)胞（1×10⁶細(xì)胞/mL）接種在6孔板中并給予特定條件的刺激,。刺激結(jié)束后,，細(xì)胞用PBS洗滌并收集。然后將它們固定在70%冰乙醇中（固定至少4 h,，固定時(shí)先用300 μL PBS重懸細(xì)胞,，緩慢滴入700 μL冰無(wú)水乙醇中,，減少細(xì)胞成團(tuán)）。固定結(jié)束后,，PBS洗滌細(xì)胞,，再懸浮在含有50 U/mL RNA酶和50 μg/mL碘化丙啶（PI）的1 mL PBS中,，然后在4°C條件下避光孵育40 min,，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析,，并計(jì)算不同階段的細(xì)胞數(shù)量。

在遇到刺激以后，巨噬細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)變化,，比如細(xì)胞大小增加,，產(chǎn)生絲足（含有肌動(dòng)蛋白絲）或板足（帶有肌動(dòng)蛋白尖峰）。因此,，細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化可以指示巨噬細(xì)胞功能的激活或抑制,。

巨噬細(xì)胞在12孔板或者6孔板中給予特定條件刺激后，用PBS洗滌細(xì)胞,，然后直接使用DAPI（1 μg/mL的PBS溶液）染色15 min,；或者使用DiOC₆與DAPI同時(shí)進(jìn)行染色。此外，細(xì)胞也可以經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定15 min后DAPI染色（300 nmol/L）30 min,。通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞及核形態(tài),。

巨噬細(xì)胞在24孔板或者6孔板中給予特定條件刺激后,，用PBS洗滌細(xì)胞，隨后在2-2.5%的戊二醛-0.1 M二甲胂酸鈉緩沖液中固定過(guò)夜,，PBS洗滌3次后用1%四氧化鋨固定2 h,，PBS洗滌3次。隨后細(xì)胞置于梯度濃度的乙醇中進(jìn)行脫水處理（通過(guò)脫水清除游離水可以使包埋劑均勻滲透）,，并在臨界點(diǎn)干燥器中干燥,，經(jīng)噴金處理后可進(jìn)行電鏡觀察。對(duì)于透射電鏡和掃描電鏡觀察,，細(xì)胞的前處理方式并不一致,，不過(guò)一般我們做電鏡觀察都是送外包的啦。

對(duì)于巨噬細(xì)胞吞噬功能的評(píng)價(jià),，我已經(jīng)在PBMC系列之——巨噬細(xì)胞知識(shí)合集,，鼠巨噬細(xì)胞的體外分離與培養(yǎng)（二）一文中為大家做了詳細(xì)的闡述，本期就不再重復(fù)啦,。

胞飲過(guò)程是另一種方式的內(nèi)吞過(guò)程,，通過(guò)該過(guò)程，巨噬細(xì)胞可以從周圍介質(zhì)中吸收液體或者其它物質(zhì),。將巨噬細(xì)胞以2×10⁴個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種至96孔板,，貼壁培養(yǎng)6 h后進(jìn)行刺激處理。刺激結(jié)束后,，棄舊培養(yǎng)液,，每個(gè)孔中加入100 μL的0.075-0.1%的中性紅溶液（PBS或培養(yǎng)基配制），孵育1-2 h后,，PBS洗去多余染色液,。然后在每個(gè)孔中加入100-200 μL的細(xì)胞裂解液（乙醇：乙酸v/v=1:1或乙醇：1 mol/L乙酸=1:1或1%冰乙酸：乙醇=1：1或1%乙酸溶液：50%乙醇=1∶1），并將混合物在室溫下培養(yǎng)4 h或過(guò)夜,。最后使用微孔板讀取器測(cè)定540 nm處的吸光度值[3],。胞飲活性可用胞飲指數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

Ca² 是細(xì)胞內(nèi)普遍存在第二信使,，參與免疫細(xì)胞多個(gè)生命活動(dòng)過(guò)程的調(diào)節(jié),，包括趨化,、粘附、促炎/抗炎細(xì)胞因子分泌等,。靜息態(tài)細(xì)胞Ca² 濃度大約在100 nM,，細(xì)胞受刺激后濃度可升高至1μM。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的Ca² 可以激活血漿和/或吞噬體膜,，導(dǎo)致胞質(zhì)Ca² 迅速升高,，可促進(jìn)部分吞噬受體對(duì)外來(lái)顆粒的攝取，并且參與調(diào)節(jié)吞噬體成熟,、周圍肌動(dòng)蛋白網(wǎng)溶解,、吞噬體與含有溶解酶顆粒物的融合以及NADPH氧化酶復(fù)合物（可生成超氧化物）激活等后續(xù)過(guò)程。此外,，胞質(zhì)Ca² 水平升高反過(guò)來(lái)還可作用于AP-1,、STAT1/3等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)促炎靶基因的表達(dá),。細(xì)胞內(nèi)Ca² 水平與巨噬細(xì)胞的活性密切相關(guān),，因此可以通過(guò)Ca² 水平檢測(cè)來(lái)部分評(píng)價(jià)巨噬細(xì)胞的活性。

Fluo-4是一種動(dòng)態(tài)單波長(zhǎng)熒光Ca² 指示劑,，熒光強(qiáng)度的增加反映了細(xì)胞質(zhì)Ca² 水平的升高,。將巨噬細(xì)胞接種在96孔板中，經(jīng)條件刺激處理后移除培養(yǎng)基,，然后將細(xì)胞與100 μL染料負(fù)載溶液孵育30 min,，檢測(cè)熒光強(qiáng)度（Ex/Em=485/535 nm）。結(jié)果也可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià),。

圖注：該圖是對(duì)胞質(zhì)Ca² 進(jìn)行的動(dòng)態(tài)檢測(cè)，圖片來(lái)源[4]

ROS對(duì)巨噬細(xì)胞的抗菌活性具有重要作用。在病原體識(shí)別和吞噬后,，NADPH氧化酶（NOX）的胞質(zhì)亞單位被磷酸化并遷移到吞噬體膜上,，形成具有膜結(jié)合亞單位的功能酶。NOX完成組裝后,，隨即吞噬體內(nèi)產(chǎn)生大量的超氧化物自由基（O₂^·—）,，該“氧化爆發(fā)”過(guò)程可長(zhǎng)達(dá)2 h。最終,，巨噬細(xì)胞胞漿中產(chǎn)生的NO會(huì)穿過(guò)吞噬體膜與超氧陰離子發(fā)生反應(yīng),，產(chǎn)生活性氮（RNS），其中包括過(guò)氧亞硝酸鹽（ONOO^—）,。這些氧化劑可誘導(dǎo)亞硝化應(yīng)激,，促進(jìn)ROS產(chǎn)生,，并且能夠殺死微生物。炎癥細(xì)胞釋放的ROS能夠通過(guò)多種方法進(jìn)行測(cè)量。

DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜,，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后,，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜,，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi),。細(xì)胞內(nèi)的ROS可以氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的DCF,。檢測(cè)DCF的熒光即可知道細(xì)胞內(nèi)ROS水平。對(duì)于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì),、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè),，也可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。測(cè)定方法：去除經(jīng)/未經(jīng)處理的巨噬細(xì)胞的上清液,，PBS洗滌后,，在37°C下用10 μM DCFH-DA（無(wú)血清培養(yǎng)基配制）染色20 min，隨后選用合適的方法進(jìn)行檢測(cè),。

細(xì)胞內(nèi)ROS也可以通過(guò)檢測(cè)CM-DCFH氧化產(chǎn)物CM-DCF的熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)量,。測(cè)定方法：除經(jīng)/未經(jīng)處理的巨噬細(xì)胞的上清液，收集細(xì)胞并用PBS洗滌,，細(xì)胞隨后與10 mM CM-DCFH在室溫條件下孵育30 min,，測(cè)定Ex/Em=485/530 nm處的熒光強(qiáng)度。

二氫羅丹明123（DHR 123）是一種非熒光且不帶電荷的ROS指示劑,，可擴(kuò)散穿透細(xì)胞膜,，進(jìn)入細(xì)胞后被氧化為陽(yáng)離子的羅丹明123，定位在線粒體上,，發(fā)射亮綠色熒光（Ex/Em=500/536 nm）,。單一的NO、超氧化物以及過(guò)氧化氫都不能氧化DHR 123,，但是當(dāng)這些ROS與其他細(xì)胞組分比如細(xì)胞色素C氧化酶或者Fe² 聯(lián)合起來(lái)能夠氧化DHR 123生成熒光衍生物羅丹明123,。測(cè)定方法：將DHR 123添加到含有經(jīng)/未經(jīng)處理的巨噬細(xì)胞中（10 μM/孔），并在室溫下孵育15–30 min,，通過(guò)熒光分光光度計(jì)分析熒光強(qiáng)度。

將巨噬細(xì)胞（2×10⁵細(xì)胞/mL）接種在96孔板上并給予特定的條件刺激,。刺激結(jié)束后將細(xì)胞進(jìn)一步與200 μL含有0.1%硝基藍(lán)四氮唑（NBT）和2 μg/mL  PMA的PBS溶液在37°C下孵育30 min,。此時(shí)，吞噬細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子能夠還原水溶性淡黃色的NBT生成藍(lán)色的 formazan,，以折光性強(qiáng)的點(diǎn)狀或斑塊狀顆粒沉積于細(xì)胞內(nèi),。隨后加入80 μL 70%甲醇終止反應(yīng)并干燥細(xì)胞，最后加入2M KOH（120 μL）以及DMSO（140 μL）溶解formazan,，讀取620/10 nm處的吸光度值,。

過(guò)氧化氫（H₂O₂）是活性氧的主要成分，是一種不帶電,、穩(wěn)定且可自由擴(kuò)散的第二信使,。吞噬細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，超氧化物歧化酶（SOD）1和2可利用超氧化物產(chǎn)生H₂O₂,。雖然超氧化物很難穿過(guò)細(xì)胞膜,，但H₂O₂很容易在胞內(nèi)外進(jìn)行擴(kuò)散,。當(dāng)H₂O₂擴(kuò)散至細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)時(shí)可能誘導(dǎo)多種分子損傷。此外,，細(xì)胞內(nèi)H₂O₂還能夠觸發(fā)下游信號(hào)通路,，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。檢測(cè)方法：經(jīng)/未經(jīng)處理的巨噬細(xì)胞中加入100 μL含過(guò)氧化物酶的酚紅緩沖液中（5 mM葡萄糖,、0.56 mM酚紅溶液和8.5 UI/mL HRP）,，在37°C下培養(yǎng)1 h后，加入10 μL 1 M NaOH終止反應(yīng),，然后讀取620 nm處吸光度值,。H₂O₂的濃度可根據(jù)H₂O₂的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定。

溶酶體在巨噬細(xì)胞的吞噬過(guò)程中具有重要作用,，巨噬細(xì)胞利用吞噬體將細(xì)菌內(nèi)化,，被吞噬的細(xì)菌將被轉(zhuǎn)移至內(nèi)吞溶酶體中進(jìn)行酶催化降解，溶酶體對(duì)細(xì)菌的降解維持巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬,。巨噬細(xì)胞富含溶酶體酶,，如酸性磷酸酶（ACP）、非特異性酯酶,、溶菌酶等,，測(cè)定這些酶的活性也是衡量巨噬細(xì)胞功能的實(shí)用指標(biāo)之一。ACP能分解β-甘油磷酸鈉釋放出磷酸基,，后者與硝酸鉛（捕捉劑）反應(yīng)產(chǎn)生無(wú)色磷酸鉛（微細(xì)沉淀,，可在電鏡下觀察），而磷酸鉛再與硫酸銨反應(yīng)則形成黑色硫化鉛（可在光鏡下觀察）,，沉積在胞漿內(nèi)酸所在處,，顯示棕黑色顆粒。測(cè)定方法：經(jīng)/未經(jīng)處理的巨噬細(xì)胞去除上清液,，加入25 μL Triton X-100（1%）和150 μL對(duì)硝基苯基磷酸鹽溶液（1 mg/mL）,，混合物在室溫孵育1 h，并加入50 μL NaOH溶液（3 M）終止反應(yīng),，讀取405 nm處吸光度值,。

轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)受體分子的mRNA表達(dá)水平,。

通過(guò)使用受體特異性抑制劑來(lái)評(píng)價(jià)該受體在特定生物學(xué)過(guò)程中的作用。

轉(zhuǎn)錄組分析的缺點(diǎn)之一是mRNA的存在并不總是精確地反映蛋白質(zhì)水平,，許多蛋白質(zhì)在翻譯水平還存在被修飾過(guò)程,，這種局限性可以通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法克服。

通過(guò)遞送21-23個(gè)核苷酸的長(zhǎng)干擾RNA（siRNA）來(lái)實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞靶mRNA降解,，用以確定相關(guān)受體在特定生物學(xué)過(guò)程中的作用,。受體蛋白干擾成功與否可通過(guò)WB確認(rèn),。

NF-κB是一種關(guān)鍵的促炎因子，可以調(diào)節(jié)多種調(diào)節(jié)受體,、細(xì)胞因子,、趨化因子和酶的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)巨噬細(xì)胞通過(guò)多種PRR途徑感知病原體時(shí),，NF-κB被激活,。NF-κB由五個(gè)亞單位的同源和異源二聚體組成，即p65/RelA,、RelB,、c-Rel、p50/NF-κB1和p52/NF-κB2,。在靜息態(tài)細(xì)胞中,，NF-κB通過(guò)與IκB（NF-κB抑制劑）蛋白如IκB-α、-β和-ε結(jié)合而定位與細(xì)胞質(zhì)中,。受到刺激后,，IκB經(jīng)IκB激酶（IKK）磷酸化后經(jīng)由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，NF-κB二聚體隨即移位至細(xì)胞核與靶基因啟動(dòng)子以及增強(qiáng)子結(jié)合,，誘導(dǎo)促炎基因的轉(zhuǎn)錄,。因此，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)NF-κB分布是一種廣泛檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子活性的方法,。關(guān)于NF-κB細(xì)胞內(nèi)分布變化的檢測(cè)主要通過(guò)兩種方法：1）細(xì)胞核-胞漿分離后使用WB檢測(cè)細(xì)胞核及胞漿中p-NF-κB水平的變化,；2）基于圖像的NF-κB追蹤，通過(guò)抗體染色或融合熒光蛋白監(jiān)測(cè)蛋白的動(dòng)態(tài)分布,。

免疫熒光分析（IFA）是一種通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)檢測(cè)和可視化細(xì)胞中蛋白表達(dá)的顯微鏡技術(shù),。

BAY 11–7082（BAY）是NF-κB抑制劑，可用于探究NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)通路的作用,。研究已經(jīng)證實(shí),，BAY可強(qiáng)烈抑制NO、PGE2和TNF-α的產(chǎn)生,，同時(shí)它還能減少p65移位及其上游信號(hào)事件的發(fā)生,，如IκB-α、IKK和Akt的磷酸化,。為了研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,，可將巨噬細(xì)胞與BAY（1 μM）孵育2 h，然后給予特定條件刺激,，最后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè),。

巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染pNF-κB-Luc質(zhì)粒（質(zhì)粒包含NF-κB反應(yīng)區(qū)、螢火蟲(chóng)熒光素酶以及抗性基因等）,，48 h后細(xì)胞進(jìn)行至少一周的抗性基因篩選,。接著挑選LPS處理后顯示出最強(qiáng)熒光素酶活性的克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),。細(xì)胞構(gòu)建成功后給予特定條件的刺激，收集細(xì)胞并進(jìn)行裂解（100 μL）,，然后將20 μL裂解液與100 μL熒光素混合并檢測(cè)化學(xué)發(fā)光情況,，結(jié)果可描述為相對(duì)熒光素酶活性（與陰性對(duì)照相比的倍數(shù)差異）。

凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）常用于檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白,。該技術(shù)的原理是蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠中的移動(dòng)速度比相應(yīng)的游離線性未結(jié)合DNA慢,。這種高靈敏度且操作簡(jiǎn)單的方法可用于研究DNA和蛋白質(zhì)相互作用。

注：研究結(jié)果表明AZM能夠抑制p65的核轉(zhuǎn)移,。胞漿和細(xì)胞核部分同時(shí)應(yīng)該跑Histone H3以及Actin蛋白,，用以證明細(xì)胞核-胞漿分離的效果，及兩者之間沒(méi)有相互污染,。

細(xì)胞因子由多種低分子量蛋白組成,，在皮摩爾或納摩爾水平即可充當(dāng)促炎或抗炎因子，調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞活動(dòng),。炎癥趨化因子則受炎性刺激產(chǎn)生,，并可促進(jìn)免疫反應(yīng)。當(dāng)兩者與其配體結(jié)合后會(huì)引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)以參與細(xì)胞功能,，包括吞噬,、細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞增殖激活等,。研究這些信號(hào)分子是研究任何炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ),。巨噬細(xì)胞激活后，可通過(guò)NF-κB促進(jìn) ①多種細(xì)胞因子表達(dá)：比如IL-1β,、IL-2,、IL-6、IL-12,、TNF-α和GM-CSF,；以及 ②多種趨化因子表達(dá)：比如IL-8、MIP-1,、MCP-1、CCL2,、調(diào)劑活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子（RANTES）,、CCL5,、eotaxin等；以及 ③誘導(dǎo)型效應(yīng)酶表達(dá)：如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和環(huán)氧合酶-2（COX-2）,。此外,，NF-κB也能激活其自身抑制劑IκB-α，隨后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與NF-κB啟動(dòng)子結(jié)合,，終止NF-κB誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活,，最終IκB-α以失活態(tài)返回細(xì)胞質(zhì)?？偟膩?lái)說(shuō),，NF-κB是一種發(fā)揮作用迅速的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)宿主感染早期的先天免疫應(yīng)答,，并與慢性炎癥和多器官衰竭相關(guān),。目前，有多種方法可用于檢測(cè)細(xì)胞因子,，其中以ELISA最為常見(jiàn),。

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法,。

IκB-α,、p-IκBα（Ser32）、STAT3,、p-STAT3（Tyr705）,、iNOS、COX-2,、p-ERK1/2,、SAPK/JNK、TNF-α,、IL-1,、IL-6、P38,、p-P38,、ERK1/2、JNK和p-JNK,，α-Tubulin,、c-jun、c-fos和β-actin等可通過(guò)Western印跡法測(cè)定,。DNA結(jié)合蛋白如p38,、SAPK/JNK、c-src、AP-1,、Ras和Akt等則可通過(guò)EMSA測(cè)定,。（上述羅列的蛋白已經(jīng)文獻(xiàn)驗(yàn)證。）

測(cè)定方法：經(jīng)/未經(jīng)刺激處理的巨噬細(xì)胞用PBS洗滌后，用5%山羊血清封閉細(xì)胞表面15 min,，或在冰上用含有10%正常小鼠血清的染色緩沖液封閉細(xì)胞表面20 min,，封閉結(jié)束后洗滌兩次。隨后,，將細(xì)胞與抗CD80,、CD40、CD86和相應(yīng)熒光標(biāo)記的單克隆抗體在4°C下孵育約30 min,。PBS洗滌后,，細(xì)胞用1%多聚甲醛固定在PBS中，對(duì)固定的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析,，每個(gè)樣品至少分析5000個(gè)細(xì)胞（細(xì)胞也可不固定直接上流式檢測(cè)）,。

cDNA微陣列技術(shù)可識(shí)別特定基因，并允許研究人員比較正常和病理?xiàng)l件下基因的表達(dá)譜,。簡(jiǎn)言之,，提取經(jīng)/未經(jīng)刺激處理的巨噬細(xì)胞的總RNA，用于cDNA合成,、標(biāo)記和微陣列雜交,。

8. Haydar, D., et al., Azithromycin Polarizes Macrophages to an M2 Phenotype via Inhibition of the STAT1 and NF-κB Signaling Pathways.Journal of Immunology (Baltimore, Md. : 1950), 2019. 203(4): p. 1021-1030.

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