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編譯：微科盟 思琦,，編輯：微科盟 景行,、江舜堯。

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1   通過病理學(xué)知情取樣策略獲得的胃癌代表性單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

研究者對手術(shù)切除的癌癥樣本中的14個(gè)組織,，包括1個(gè)正常黏膜組織、6個(gè)分化的癌癥（DGC）組織,、6例低分化的癌癥（PDGC）組織和1個(gè)神經(jīng)內(nèi)分泌癌（NEC）組織,，采用病理學(xué)知情取樣策略并進(jìn)行了基于液滴的scRNA-seq（10X Genomics），樣本均通過組織病理學(xué)檢查得到證實(shí)（表S1）,。神經(jīng)內(nèi)分泌癌組織和相應(yīng)的腺癌組織來自病理診斷為混合型腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌（MANEC）的同一腫瘤,。

經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制，保留了46883個(gè)細(xì)胞用于進(jìn)一步分析,，每個(gè)細(xì)胞的中位值基因數(shù)和特異性分子標(biāo)記（UMI）分別為1723和5480（圖S1A）,。降維聚類后，基于公認(rèn)的標(biāo)記基因的表達(dá)識別出8個(gè)細(xì)胞簇,，捕獲的細(xì)胞明顯分為上皮細(xì)胞（EPCAM和KRT8）,、成纖維細(xì)胞（THY1和DCN）、內(nèi)皮細(xì)胞（PECAM1和CDH5）,、髓系細(xì)胞（C1QA和CD163）,、T/NK細(xì)胞（CD3D和CD3E）、B細(xì)胞（CD79A和MS4A1）,，漿細(xì)胞（MZB1）和肥大細(xì)胞（KIT和TPSAB1）（表S2和圖1A,，B）。這些細(xì)胞類型的百分比在腫瘤樣本中有所不同,，上皮細(xì)胞和T/NK細(xì)胞占大多數(shù)（圖S1B-E）,。

研究者在數(shù)據(jù)中捕獲了一個(gè)正常黏膜組織，并根據(jù)公認(rèn)的細(xì)胞標(biāo)記將該樣本的上皮細(xì)胞分為祖細(xì)胞,、表面細(xì)胞,、主細(xì)胞、壁細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞（圖1C和圖S1F）,。然后,，研究者評估了腫瘤組織上皮細(xì)胞的CNV水平,，每個(gè)腫瘤樣本中都存在高CNV和低CNV上皮細(xì)胞（圖1D,，E）,。通過相應(yīng)激光捕獲顯微切割組織的WES數(shù)據(jù)證實(shí)了高CNV的細(xì)胞（圖S2A）。為了對惡性細(xì)胞和非惡性上皮細(xì)胞進(jìn)行分類,，研究者將聚類和CNV數(shù)據(jù)相結(jié)合,，將惡性細(xì)胞與非惡性細(xì)胞區(qū)分（圖S1G,，H）,，得到11個(gè)惡性細(xì)胞簇和7個(gè)非惡性細(xì)胞簇（表S3、圖1F和圖S1I,，J）,。來自不同患者的腫瘤樣本中的非惡性上皮細(xì)胞與來自正常黏膜的上皮細(xì)胞聚集在一起，而惡性細(xì)胞聚集在一起并與非惡性上皮細(xì)胞簇分離（圖S2B,，C）,。通過比較惡性和非惡性上皮細(xì)胞，研究者發(fā)現(xiàn)惡性細(xì)胞失去了消化和防御功能,，但增強(qiáng)了蛋白質(zhì)合成活性和代謝（表S4和圖1G,，I）。研究者還評估了惡性和非惡性細(xì)胞的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRN）,，并根據(jù)不同患者對上皮細(xì)胞進(jìn)行分類的GRN對其進(jìn)行聚類（圖S2D）,。在惡性細(xì)胞中鑒定出GRN，如YY1,、RAD21,、RARG、TP63和CERBPB,，而在非惡性上皮細(xì)胞中鑒定了幾種GRN,，包括SP1、IRF7,、IRF9,、FOXA1和KLF2（圖1H）,。

研究者評估了惡性細(xì)胞簇的不同特征,，發(fā)現(xiàn)內(nèi)分泌細(xì)胞具有一些胰腺β細(xì)胞樣特征，表現(xiàn)出與分泌相關(guān)的特征（圖1J和圖S2G）,。此外,，T1和T6簇代具有干擾素α和γ反應(yīng)特征，這意味著T1和T6集群顯示出獨(dú)特的免疫相關(guān)特征（圖1J,，K和圖S2E,，F(xiàn)）。研究者還評估了上皮細(xì)胞簇中的代謝相關(guān)活性,，發(fā)現(xiàn)T6中的甘油脂和甘油磷脂代謝活性高于其他惡性細(xì)胞簇（圖S2H,，I）。

圖1.胃癌的代表性單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組景觀,。（A）UMAP圖顯示不同的細(xì)胞類型（n=46883）,，病理信息包括分化型胃癌（DGC）、低分化胃癌（PDGC）和神經(jīng)內(nèi)分泌癌（NEC）。（B）不同細(xì)胞類型的對應(yīng)標(biāo)志物的表達(dá),。（C）正常黏膜組織的UMAP圖（n=2232）,。（D）熱圖顯示了從單細(xì)胞RNA數(shù)據(jù)推斷的大規(guī)模拷貝數(shù)變異（CNV）的染色體景觀,。（E）小提琴圖顯示每種樣本的非惡性和惡性上皮細(xì)胞的CNV偏差,。（F）UMAP圖顯示不同的上皮細(xì)胞簇。（G）熱圖顯示惡性和非惡性上皮細(xì)胞之間差異表達(dá)基因（DEG）,。顯示部分基因名稱,，完整基因列表見表S4。（H）在惡性和非惡性上皮細(xì)胞中鑒定的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRNs）,。顯示部分轉(zhuǎn)錄因子名稱,。（I）基因富集分析顯示，與非惡性上皮細(xì)胞相比,，惡性上皮細(xì)胞的信號通路相對上調(diào)或下調(diào),。（J）熱圖顯示了惡性和非惡性上皮細(xì)胞中標(biāo)志性基因集的表達(dá)分?jǐn)?shù)。（K）小提琴圖顯示不同上皮細(xì)胞簇中干擾素α和γ相關(guān)基因的表達(dá)水平,。

2   通過比較DGC與PDGC來確定癌細(xì)胞的分化特征  

研究者將DGCs和PDGC的轉(zhuǎn)錄組與明確的病理診斷進(jìn)行比較,，以闡明它們的分子差異（圖2A，B）,。來自PDGC和DGC的惡性細(xì)胞的DEG,，CLDN3、FABP1,、S100A10和PHGR1在DGC中的表達(dá)顯著較高,，而上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因如VIM、LAMB3,、LAMC2,，COL6A1和COL17A1在PDGCs中特異性表達(dá)，表明EMT特征在PDGC中富集（表S5,、圖2C,、D和圖S3A）。PDGC中富集了與EM相關(guān)的術(shù)語,，如粘著斑,、對創(chuàng)傷的反應(yīng)、細(xì)胞遷移的正調(diào)控和細(xì)胞-細(xì)胞粘附（圖2E）,。與非惡性上皮細(xì)胞相比,，PDGC中的上調(diào)和下調(diào)的DEG數(shù)量多于DGCs（圖S3B，S3D）,。此外,，HIF1A主要在PDGC中表達(dá),，表明PDGC可能存在更強(qiáng)的缺氧（圖S3E）。

為了評估DGC和PDGC的基因表達(dá)程序,，研究者使用非負(fù)矩陣分解（NMF）方法分析不同癌癥類型的惡性細(xì)胞,。研究者發(fā)現(xiàn)，EMT,、上皮相關(guān)和代謝/能量程序在PDGC中富集,，基因富集分析證實(shí)了這一點(diǎn)，而吸收/運(yùn)輸,、細(xì)胞周期,、胞吞、白細(xì)胞介素相關(guān)信號,、代謝/能量,、蛋白質(zhì)成熟、蛋白質(zhì)加工和對外部刺激程序的反應(yīng)在DGC中富集（圖2F）,。

基于與DGC惡性細(xì)胞高度相關(guān)的上調(diào)基因,，研究者使用lasso回歸和隨機(jī)森林方法來去除低貢獻(xiàn)基因。最后,，研究者確定了與胃癌分化狀態(tài)相關(guān)的基因集,，包括AGR3、CLDN3,、CLDN 4,、FABP1、LGALS4,、PHGR1,、MYH14和S100A14（表S6和圖S3F，G）,。已確定的腫瘤分化基因集在DGC中的表達(dá)明顯高于在PDGC（圖2G和圖S3H）,。該基因特征清楚地定義了DGC，尤其是數(shù)據(jù)集中的T1和T6簇（圖2H）,。此外,，研究者提出了一種基于所有惡性細(xì)胞上調(diào)標(biāo)志物的評分作為腫瘤評分。腫瘤評分與腫瘤分化基因集呈負(fù)相關(guān),，這表明癌癥細(xì)胞分化水平越高，腫瘤的惡性程度越低（圖2I）,。此外,，在TCGA數(shù)據(jù)庫中，分化基因集的高表達(dá)與腸型胃癌的整體生存率較高顯著相關(guān)（圖2J）,。

圖2.分化型胃癌（DGC）和低分化胃癌（PDGC）的比較,。（A）DGC、PDGC和神經(jīng)內(nèi)分泌癌（NEC）中惡性細(xì)胞的百分比。（A）UMAP圖顯示DGC,、PDGC和NEC的上皮細(xì)胞的分布,。（C）熱圖顯示DGC和PDGC的惡性上皮細(xì)胞之間差異表達(dá)基因。顯示了部分基因名稱,，完整的基因列表見表S5,。（D）小提琴圖顯示了DGC和PDGC中EMT相關(guān)基因的表達(dá)水平。（E）基因富集分析顯示PDGC中相對上調(diào)的功能,。（F）非負(fù)矩陣分解（NMF）顯示DGC和PDGC的轉(zhuǎn)錄組程序特征,。（G）小提琴圖顯示了參與DGC和PDGC分化評分的基因的表達(dá)水平（通過wilcox檢驗(yàn)計(jì)算的***-p＜0.0001）。（H）UMAP圖顯示分化評分,。（I）腫瘤分化評分與腫瘤評分的相關(guān)性,。（J）Kaplan-Meier生存（天）曲線顯示了TCGA數(shù)據(jù)集中腸型癌患者的高分化評分和低分化評分生存率。

3   分化特征與免疫浸潤相關(guān)基因部分重疊

接下來,，為了研究癌細(xì)胞的分化特征與相應(yīng)免疫微環(huán)境特征之間的關(guān)系,，研究者根據(jù)腫瘤浸潤C(jī)D8 T細(xì)胞的密度將患者分為免疫低下型和免疫豐富型。研究者發(fā)現(xiàn),，惡性細(xì)胞在免疫低下型的比例更高,，這表明免疫低下腫瘤中的惡性細(xì)胞密度很高，如H＆E染色所示（圖3A,，B）,。研究者在免疫低下型中確定了S100A2、CAV1,、CAV2和ANXA1等標(biāo)記和GO術(shù)語,，包括粘著斑、整合素相關(guān)通路和對創(chuàng)傷的反應(yīng),，而在免疫豐富型中確定了LAGLS4,、CLDN3和PIGR等基因和GO術(shù)語包括粒細(xì)胞遷移、中性粒細(xì)胞降解和胞吞（表S7,、圖3C和圖S4A）,。此外，使用TCGA數(shù)據(jù)集中MSI-H和MSI-L的癌癥樣本來確認(rèn)免疫低下型和免疫富集型之間的DEGs,，正如預(yù)期的那樣,，免疫低下型腫瘤組織中的惡性細(xì)胞標(biāo)記物在MSI-L樣本中有較高的表達(dá)，而免疫富集型腫瘤組織中的惡性細(xì)胞標(biāo)志物在MSI-H樣本中有更高的表達(dá)（圖3D）,。免疫豐富型和免疫低下型的惡性細(xì)胞在惡性簇中的百分比不同,，免疫豐富型腫瘤組織中的惡性細(xì)胞在T1、T6和T7簇中富集（圖S4C）,。此外,，研究者根據(jù)免疫相關(guān)基因集分析了惡性細(xì)胞的擬時(shí)序軌跡,，并確定了惡性細(xì)胞從免疫豐富型到免疫低下型的軌跡，表明這兩種類型之間的連續(xù)轉(zhuǎn)變（圖S4B）,。

研究者利用免疫反應(yīng)的幾個(gè)標(biāo)志性特征和GO基因集對免疫豐富型和免疫低下型的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行評分,。免疫豐富型腫瘤中的癌細(xì)胞往往具有較高的干擾素α和干擾素γ相關(guān)基因表達(dá)（圖3E和圖S4D）。干擾素γ相關(guān)基因（包括CCL20,、CCL25和CD74）和抗原呈遞相關(guān)基因（如HLA-DPA1,、HLA-DRA和HLA-DRB）在免疫豐富型腫瘤的癌癥細(xì)胞中顯著上調(diào)（圖3F）。此外,，為了確定腫瘤細(xì)胞對浸潤性T細(xì)胞的反應(yīng),，研究者研究了耗竭和共刺激受體，發(fā)現(xiàn)與免疫低下型相比,，免疫豐富型腫瘤的癌細(xì)胞顯示出相應(yīng)的耗竭配體相關(guān)和共刺激配體相關(guān)基因的更高表達(dá)（圖3G）,。同時(shí)，與耗竭配體和共刺激配體基因集高度相關(guān)的標(biāo)志性基因特征在免疫相關(guān)活性中富集,，如干擾素γ反應(yīng),、干擾素α反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和補(bǔ)體活性（圖3H）,。研究者還在TCGA數(shù)據(jù)集中篩選了這些特征,，發(fā)現(xiàn)MSI-H胃癌樣本中干擾素α/γ應(yīng)答基因、耗竭配體和共刺激配體基因表達(dá)更高,，這些樣本的特征是高度免疫浸潤（圖3I）,。

從熱圖中可以看出，免疫低下型和免疫豐富型之間的DEGs總體上與PDGC和DGC之間的DEGs重疊,，并且免疫豐富型中的惡性細(xì)胞比免疫低下型的惡性細(xì)胞具有更高的分化得分（圖3J,，K）。研究者還確定了與干擾素γ和干擾素α通路高度相關(guān)的基因,，它們在免疫豐富型和免疫低下型的惡性細(xì)胞中差異表達(dá)（圖S4E）,。例如，PHGR1和CLDN3在免疫豐富型的惡性細(xì)胞中表現(xiàn)出更高的表達(dá),，并且主要在T1和T6簇中表達(dá)（圖S4F）,。同時(shí)，在TCGA數(shù)據(jù)庫中,，它們的表達(dá)與腸型胃癌的更好預(yù)后相關(guān)（圖S4G）,。最后，研究者還確定了與干擾素α/γ信號高度相關(guān)的代謝活性,，并發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)相關(guān)特征,，如視黃醇代謝和類固醇激素生物合成，與免疫豐富型呈正相關(guān)（圖S4H,，I）,，而丙酮酸相關(guān)特征，如嘌呤代謝,、丙酮酸代謝和嘧啶代謝,，與免疫豐富型呈負(fù)相關(guān)。

圖3.免疫浸潤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,。（A）免疫豐富型和免疫低下型樣本中惡性細(xì)胞的百分比,。（B）UMAP圖顯示了來自免疫豐富型和免疫低下型樣品的上皮細(xì)胞的分布。（C）熱圖顯示免疫豐富型和免疫低下型胃癌之間差異表達(dá)的基因,。顯示部分基因名稱,，完整基因列表見表S7。（D）小提琴圖顯示了來自TCGA數(shù)據(jù)集的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高（MSI-H）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性低（MSI-L）樣本中免疫豐富型的惡性細(xì)胞的標(biāo)記物的表達(dá)水平（通過t檢驗(yàn)計(jì)算的ns-P＞=0.05,，*-P＜0.05,，**-P＜0.001，***-P＜0.001,，****-P＜0.0001）,。（E）小提琴圖顯示免疫豐富型和免疫低下型胃癌中免疫反應(yīng)的特征基因和GO基因集的表達(dá)水平。（F）小提琴圖顯示免疫富集型和免疫低下型胃癌中干擾素γ相關(guān)基因和抗原呈遞相關(guān)基因的表達(dá)水平,。（G）小提琴圖顯示免疫豐富型和免疫低下型胃癌中耗竭配體相關(guān)和共刺激配體相關(guān)基因的表達(dá)水平,。（H）標(biāo)志基因特征與耗竭配體和共刺激配體基因集高度相關(guān)。（I）小提琴圖顯示了TCGA數(shù)據(jù)集MSI-H和MSI-L樣本中MSI-H胃癌樣本中干擾素α/γ相關(guān)基因,、耗竭配體和共刺激配體相關(guān)基因的表達(dá)水平（通過t檢驗(yàn)計(jì)算的ns-P＞=0.05,，*-P＜0.05，**-P＜0.01,，***-P＜0.001,，****-P＜0.0001）。（J）小提琴圖顯示免疫豐富型和免疫低下型胃癌分化評分,。（K）免疫豐富型和免疫低下型樣本的蘇木精-伊紅染色,，以及CD8和其他差異表達(dá)蛋白的免疫組化染色的代表性圖像。比例尺,，300μm,。

4   腫瘤浸潤性T細(xì)胞的特征及其與惡性細(xì)胞的相互作用   

為了詳細(xì)描述NK/T細(xì)胞簇以及T細(xì)胞和惡性細(xì)胞之間的聯(lián)系，研究者分析了所有T細(xì)胞,，并根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)記將其分為17個(gè)簇,，包括3個(gè)NK或γ/δT細(xì)胞簇、4個(gè)CD8 T細(xì)胞簇,，6個(gè)CD4 T細(xì)胞團(tuán)簇和4個(gè)具有其他特定特征的T細(xì)胞簇（圖4A,，B）。這些簇在不同的腫瘤樣本中分布相對均勻（圖4C）,。在這些T細(xì)胞簇中,，STMN1 T細(xì)胞代表細(xì)胞周期特征,，并包含CD8 T和CD4 T細(xì)胞（圖S5A）。對于四個(gè)CD8 T細(xì)胞簇（GZMB CD8 T細(xì)胞,、GZMH CD8 T細(xì)胞,、GZMK  CD8 T細(xì)胞和TNFSF9 CD8 T細(xì)胞），GZMB CD8 T細(xì)胞和GZMH CD8 T細(xì)胞比其他細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性能力,，而與其他CD8 T細(xì)胞相比,，GZMB CD8 T細(xì)胞具有特定的耗竭特征（圖4D）。研究者篩選出了主要在GZMB CD8 T細(xì)胞中表達(dá)的耗竭相關(guān)基因,，如PDCD1,、CTLA4和HAVCR（圖S5B）。

DGC和免疫豐富型的T細(xì)胞是捕獲的大部分T細(xì)胞（圖4E）,。此外,，所有四種主要功能性CD8 T細(xì)胞類型都在免疫豐富型中顯著富集，這與病理結(jié)果一致（圖S5C,，D）,。研究者發(fā)現(xiàn)，來自免疫豐富型的GZMB CD8 T細(xì)胞CXCL13的表達(dá)較高（圖4F和圖S5E）,，據(jù)報(bào)道,，這可能與三陰性乳腺癌免疫治療的良好反應(yīng)有關(guān)。此外,，研究者發(fā)現(xiàn)能量產(chǎn)生功能,，如氧化磷酸化、糖酵解/糖異生和檸檬酸循環(huán),，與細(xì)胞毒性和耗竭特征呈正相關(guān)（圖S5F,，G），表明CD8 T細(xì)胞的細(xì)胞毒性和耗竭功能可能消耗更多的能量,。

然后,，研究者對細(xì)胞間通信進(jìn)行了深入分析。對于不同的惡性細(xì)胞簇和CD8 T細(xì)胞簇,，研究者發(fā)現(xiàn)耗竭相關(guān)配體主要富集在T1,、T4和T6惡性細(xì)胞簇中，耗竭相關(guān)受體主要富集在GZMB CD8 T細(xì)胞中,，尤其是LAGLS3-LAG3,、CEACAM1-HAVCR2和NECTIN4-TIGIT等相互作用，這表明惡性細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞參與了T細(xì)胞耗竭（圖4G）,。關(guān)于免疫類型和不同類型的CD8 T細(xì)胞之間的通訊,，研究者確定了惡性細(xì)胞和GZMB CD8 T細(xì)胞與耗竭相關(guān)的相互作用，而相應(yīng)的配體分布在免疫低下和免疫豐富的惡性細(xì)胞中，尤其是LAGLS3-LAG3和HLAB-KLRD1等相互作用（圖4G）,。此外,，研究者還確定了惡性細(xì)胞和CD4 T細(xì)胞之間的相互作用。NECTIN4-TIGIT和MYL9-CD69等相互作用分布在幾乎所有不同類型的惡性細(xì)胞和CD4 T細(xì)胞的相互作用中,，但它們在CXCL13 CD4 T細(xì)胞中更具特異性（圖S5H）,。

圖4.腫瘤浸潤T細(xì)胞的特征以及與惡性細(xì)胞的相互作用,。（A）UMAP圖顯示不同的T細(xì)胞簇,。（B）不同T細(xì)胞簇的對應(yīng)標(biāo)志物的表達(dá)。（C）每個(gè)樣本中不同類型T細(xì)胞的百分比,。（D）不同類型CD8 T細(xì)胞中的共刺激,、細(xì)胞毒性、耗竭和駐留T細(xì)胞特征評分,。（E）UMAP圖顯示了T細(xì)胞在PDGC和DGC,、免疫豐富型和免疫低下型中的分布。（F）熱圖顯示免疫豐富型和免疫低下型胃癌GZMB CD8 T細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因,。顯示部分基因名稱,。（G）通過使用工具包NATMI的細(xì)胞通訊分析推斷的上皮細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞之間的相互作用。 

5   混合型腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變

在測序的12名患者中,，2名患者患有MANEC,，其被定義為一種胃癌，具有典型腺癌和神經(jīng)內(nèi)分泌癌的形態(tài)學(xué)和免疫表型特征,。結(jié)合形態(tài)學(xué)和免疫組化分析,，研究者確定了這2種MANEC腫瘤中的三種主要成分：分化型腺癌、中間狀態(tài)癌細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌癌,。中間狀態(tài)癌細(xì)胞是指在形態(tài)上介于分化型腺癌和神經(jīng)內(nèi)分泌癌之間,，但不表達(dá)分化型腺癌（MUC5AC和MUC6）或神經(jīng)內(nèi)分泌癌（Syn和CgA）標(biāo)記的腫瘤成分，盡管在病理檢查中為分化型腺癌（圖5A）,。

由于兩名患者均有分化型胃腺癌和神經(jīng)內(nèi)分泌癌成分,，研究者結(jié)合分化型胃癌、中間狀態(tài)和神經(jīng)內(nèi)分泌癌的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)探討神經(jīng)內(nèi)分泌成分的來源,。在數(shù)據(jù)集中分析了DGC和NEC之間的DEG和差異表達(dá)的TF,，并鑒定了內(nèi)分泌相關(guān)特征和NEC特異性基因，如CGA,、CHGA和CHGB,，以及NEC特有的TF，如HMGN3,、HOXD11和FEV（圖S6D）,。所有上皮細(xì)胞的PCA減少顯示出從分化的胃腺癌轉(zhuǎn)變?yōu)橹虚g狀態(tài)，然后轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)內(nèi)分泌癌（圖S6A）,。基于PCA成分,，研究者創(chuàng)建了所有上皮細(xì)胞從非惡性上皮細(xì)胞（DGC到NEC）的擬時(shí)序軌跡,，識別出上皮細(xì)胞的三種狀態(tài)及其不同的特征（圖5B）。研究者確定了隨著轉(zhuǎn)分化逐漸變化的基因,。KRT20,、PHGR1、PIGR和CLDN3逐漸下調(diào),，而PDCD5,、CPNE1、PDCD2,、GLO1,、APOA1和CGA上調(diào)（圖5C和圖S6B），表明隨著神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物表達(dá)的增加,，分化評分逐漸降低,。分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如KLF2、KLF3和FOXA3被下調(diào),，內(nèi)分泌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,，如HOXA7、FEV和LMX1A隨著轉(zhuǎn)分化逐漸上調(diào)（圖5D）,。特別是,，免疫療法的潛在靶點(diǎn)，包括MUC1,、CEACAM5和CLDN18,，隨著轉(zhuǎn)分化逐漸下調(diào)。相反,，CTAG2是一種癌-睪丸抗原,，并逐漸上調(diào)（圖5F）。此外,，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)集,，APOA1和CGA的表達(dá)與胃癌的預(yù)后較差相關(guān)，CGA是NEC的典型標(biāo)記物（圖5G）,。研究者注意到,，中間狀態(tài)的惡性細(xì)胞既不表達(dá)公認(rèn)的DGC特征基因（MUC1、KRT20,、PHGR1）,，也不表達(dá)NEC特征基因（SCG3、CGA,、CHGB）,，這與上述形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致。標(biāo)志基因集結(jié)果顯示了轉(zhuǎn)分化的變化特征，并且未折疊蛋白反應(yīng),、脂肪酸代謝,、糖酵解和MYC靶標(biāo)等特征在中間狀態(tài)中顯著富集（圖5E）。包括LGALS1,、DDIT4和EIF4G1在內(nèi)的幾個(gè)基因也在中間狀態(tài)下富集（圖S6C）,。

在DGC到NEC的轉(zhuǎn)分化過程中也發(fā)現(xiàn)了干擾素相關(guān)通路的負(fù)相關(guān)（圖5E和圖S6E，F(xiàn)）,。惡性細(xì)胞中免疫應(yīng)答的減少伴隨著IHC染色中CD8 T細(xì)胞浸潤的減少（圖S6B）,。干擾素相關(guān)通路中特異性基因的分析也證實(shí)了類似的相關(guān)性，如CASP1,、CD74,、B2M、ITM3和I27的表達(dá),，它們與NEC特征呈負(fù)相關(guān)（圖S6G）。

圖5.混合型腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變,。（A）來自同一混合腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌的腺癌,、中間狀態(tài)和神經(jīng)內(nèi)分泌癌（NEC）成分中MUC6、MUC5AC,、Syn和CgA的免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色的代表性圖像,。比例尺，300μm,。（B）所有上皮細(xì)胞從非惡性上皮細(xì)胞,、惡性細(xì)胞從分化型胃腺癌（DGC）到NEC的擬時(shí)序軌跡。（C）熱圖顯示了隨著DGC到NEC的轉(zhuǎn)分化過程逐漸改變的基因,。顯示部分基因名稱,。（D）在NEC和DGC的惡性細(xì)胞中鑒定的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。顯示部分TF名稱,。（E）熱圖顯示了標(biāo)志性基因集隨著DGC到NEC的轉(zhuǎn)分化過程的表達(dá)得分,。（F）PCA圖顯示非惡性上皮細(xì)胞以及DGC和NEC的上皮細(xì)胞中CHGA和CTAG2的表達(dá)。（G）Kaplan-Meier生存曲線顯示了TCGA數(shù)據(jù)集中APOA1和CGA高表達(dá)和低表達(dá)的胃癌患者的生存期（天）,。

6   胃癌髓系細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征

巨噬細(xì)胞占髓系細(xì)胞的主要部分（鑒定出9個(gè)簇,，具有不同的標(biāo)記基因，如FCN1,、C1QA,、CCL18、HSPA18,、SPP1,、CXCL10、INHBA、CDKN1C和MT1G）,，根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)記基因還鑒定了其他細(xì)胞簇,，如CD1C DC、CCR7 DC,、LTB DC,、FCGR3B 中性粒細(xì)胞和循環(huán)髓系細(xì)胞。其中,，F(xiàn)CN1 巨噬細(xì)胞和C1QA 巨噬細(xì)胞在髓系細(xì)胞中所占比例最大（圖6A,，C）。對于巨噬細(xì)胞,，幾個(gè)基因集,，如M1極化基因集、M2極化基因集,，促炎基因集和抗炎基因集,，用于對巨噬細(xì)胞進(jìn)行評分，所有巨噬細(xì)胞簇都傾向于表現(xiàn)出M2極化特征（圖6B）,。研究者確定了上述特征與代謝活性的具有正相關(guān),，如脂肪酸生物合成和煙酸相關(guān)代謝，以及與能量代謝的不同相關(guān)性,，如TCA循環(huán)和氧化磷酸化（圖6D）,。

此外，研究者篩選了髓系細(xì)胞在不同分類中的分布,，如DGCs和PDGC,，以及免疫豐富型和免疫低下型。研究者觀察到,，與免疫豐富型相比,，免疫低下型INHBA 巨噬細(xì)胞的比例增加，與DGCs相比,，NECs中INHBA 巨噬細(xì)胞比例增加,，這與上述發(fā)現(xiàn)一致，表明INHBA 巨噬細(xì)胞可能通過抑制免疫反應(yīng)影響胃癌（圖6E,，F(xiàn)）,。最后，研究者確定了惡性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的配體-受體相互作用對,。對于免疫豐富和免疫低下型的惡性細(xì)胞,，研究者在CDKN1C 巨噬細(xì)胞-惡性細(xì)胞和CXCL10 巨噬細(xì)胞-惡性細(xì)胞對中確定了TNFSF10-TNFRSF11B的特異性相互作用，這對應(yīng)了TNFRSF11B在免疫應(yīng)答中的抑制功能（圖6G）,。

圖6.胃癌髓系細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征,。（A）UMAP圖顯示癌癥髓系細(xì)胞的不同簇,。（B）髓系細(xì)胞中M1極化基因集、M2極化基因集,，促炎癥基因集和抗炎癥基因集的表達(dá)得分,。（C）不同髓系細(xì)胞簇的相應(yīng)標(biāo)志物的表達(dá)。（D）髓系細(xì)胞中代謝活性相關(guān)基因集與M1極化基因集,、M2極化基因集,，促炎癥基因集和抗炎癥基因集的相關(guān)性。（E）免疫豐富型和免疫低下型胃癌,、分化型胃癌（DGC）,、低分化型胃癌（PDGC）和神經(jīng)內(nèi)分泌癌（NEC）中不同類型髓系細(xì)胞的百分比。（F）UMAP圖顯示了髓系細(xì)胞在NEC,、PDGC和DGC,、免疫豐富型和免疫低下型中的分布。（G）使用NATMI工具包的細(xì)胞通訊分析推斷免疫低下/豐富型上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的相互作用,。

本研究的病理知情采樣策略提供了測序的腫瘤組織的確切病理信息,，以最大限度地減少腫瘤內(nèi)高異質(zhì)性的影響，從而更好的區(qū)分DGC和PDGC以及免疫低下型和免疫豐富型,。此外,，研究者從RNA數(shù)據(jù)推斷的CNV信息也可以通過激光捕獲顯微切割相應(yīng)組織的WES數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。利用這一點(diǎn)和單細(xì)胞測序技術(shù),，研究者通過結(jié)合聚類和CNV信息來明確區(qū)分惡性細(xì)胞和非惡性上皮細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞更準(zhǔn)確的聚類,。通過比較DGC和PDGC,，研究者確定了PDGC中富含的EMT特征，這與低分化狀態(tài)相關(guān)的惡性類型一致,。更有趣的是,，研究者的分化特征與通過比較免疫豐富型和免疫低下型篩選出的免疫浸潤相關(guān)基因重疊。

本研究中最有趣的發(fā)現(xiàn)是混合型腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變,。研究者構(gòu)建了從DGCs到NEC的所有惡性細(xì)胞的擬時(shí)序軌跡,，并確定了隨著轉(zhuǎn)分化逐漸變化的基因，表明其趨向于Nikolas etal報(bào)道的小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌狀態(tài),。作為免疫療法的潛在靶點(diǎn)的MUC1,、CEACAM5和CLDN18逐漸下調(diào)，表明在神經(jīng)內(nèi)分泌分化過程中,，免疫攻擊的逃避越來越多,。中間狀態(tài)的惡性細(xì)胞顯示DGC和NEC標(biāo)記基因的雙陰性特征，代表可能與胃癌進(jìn)展相關(guān)的“干細(xì)胞/祖細(xì)胞”特征,。與前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌的研究類似,，發(fā)現(xiàn)很多轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)分化過程中差異表達(dá),。新發(fā)現(xiàn)是DGC到NEC轉(zhuǎn)分化過程發(fā)現(xiàn)的干擾素相關(guān)通路呈負(fù)相關(guān)，這伴隨著IHC染色中CD8 T淋巴細(xì)胞浸潤減少,，支持神經(jīng)內(nèi)分泌分化作為胃癌免疫逃避機(jī)制,，未來需要進(jìn)一步的功能研究。