1. 單細(xì)胞RNA-seq確定胃癌的七種主要細(xì)胞類(lèi)型

作者收集了9例未經(jīng)治療的非轉(zhuǎn)移性胃癌患者的新鮮腫瘤樣本和鄰近非腫瘤樣本,，其中6名患者患有近端胃癌（標(biāo)記為P01-P06），3名患者患有遠(yuǎn)端胃癌（標(biāo)記為D01-D03）,。進(jìn)行生信分析后共獲得47304個(gè)細(xì)胞,，可檢測(cè)到200多個(gè)基因的表達(dá)，可以使用基于圖的聚類(lèi)獲得17個(gè)細(xì)胞簇（圖1B）,?；诘湫蜆?biāo)記基因的表達(dá)和這些簇頂部不同表達(dá)的基因，研究將這些簇分為七種主要細(xì)胞類(lèi)型,，包括T細(xì)胞和NK細(xì)胞（6簇）,、B細(xì)胞（2簇）、髓樣細(xì)胞（2簇）,、肥大細(xì)胞（1簇）,、成纖維細(xì)胞（3簇）、內(nèi)皮細(xì)胞（1簇）,、上皮細(xì)胞和惡性細(xì)胞（3簇）,。

圖1 胃癌及鄰近非惡性標(biāo)本的單細(xì)胞RNA-seq

2. 胃癌中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的顯著擴(kuò)增

接下來(lái)，作者對(duì)T細(xì)胞和NK細(xì)胞進(jìn)行重新分類(lèi),，確定了14個(gè)不同的簇（圖2A）,。基于典型標(biāo)記基因的表達(dá)和每個(gè)簇的差異表達(dá)基因（圖2B），研究將這些簇注釋為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,、CD4+T細(xì)胞,、CD8+T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和固有淋巴細(xì)胞（ILC）,。對(duì)于CD4+細(xì)胞簇,，T01被表征為具有CCR7特異性表達(dá)的天然CD4+T細(xì)胞。根據(jù)特異性表達(dá)的CXCL13,，T04被歸類(lèi)為濾泡幫助T細(xì)胞,，并且該簇增加了PDCD1和TIGIT的表達(dá)，表明處于耗盡狀態(tài),。事實(shí)上,，Treg信號(hào)基因在腫瘤樣本中表現(xiàn)出一致的高表達(dá)（圖2D）。與正常Treg相比,，腫瘤Treg增加了與免疫抑制相關(guān)的多個(gè)基因的表達(dá),，包括DUSP4、IL2RA,、TNFRSF4,、LAYN和LGALS1（圖2E）。腫瘤中Treg含量的增加,，以及這些基因和通路的表達(dá)上調(diào)（圖2F）,，這表明胃癌微環(huán)境的免疫抑制性質(zhì)。

圖2 胃癌中T細(xì)胞和NK細(xì)胞的分布

3. 在胃癌中未發(fā)現(xiàn)典型的耗盡性CD8+T細(xì)胞簇

作者分析了CD8+T細(xì)胞的兩個(gè)主要簇（T05和T06）（圖2A）,。T05被鑒定為具有GZMK高表達(dá)和一組細(xì)胞毒性基因的效應(yīng)記憶CD8+T細(xì)胞（TEM）,。根據(jù)KLRC1和ITGA1/CD103的表達(dá)增加，T06被歸類(lèi)為組織駐留記憶T細(xì)胞（TRM）,。有趣的是,，在數(shù)據(jù)集中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)典型的耗盡型CD8+T細(xì)胞簇，這種細(xì)胞簇在各種腫瘤類(lèi)型中經(jīng)常被檢測(cè)到（圖2B）,。

4.在胃癌中鑒定腫瘤特異性L(fǎng)AMP3+DC細(xì)胞

作者重新構(gòu)建骨髓細(xì)胞簇并確定了15個(gè)簇（圖3A）,，之后作者基于S100A8、S100A9和FCN1在這些簇中的高表達(dá),，M01-M03被鑒定為單核細(xì)胞（圖3B-C）,。M04-M07是基于低表達(dá)CD14和高表達(dá)HLA-DR基因的樹(shù)突狀細(xì)胞（圖3B-C）。由于這些簇中CD68,、CD163和MRC1的高表達(dá),，M08-M11因此被鑒定為巨噬細(xì)胞（圖3B-C），其余三個(gè)未分類(lèi)簇（M12,、M13和M15）可能來(lái)自低質(zhì)量細(xì)胞或雙細(xì)胞,。

另外,，M04高表達(dá)CD1C、FCER1A和CLEC10A對(duì)應(yīng)cDC2（圖3C）,，M05高表達(dá)CLEC9A代表cDC1(圖3C),，M07通過(guò)LILRA4的特異表達(dá)被鑒定為漿細(xì)胞樣DC（pDC），但是作者注意到高表達(dá)LAMP3,、CCL22和CCL19的M06與任何經(jīng)典DC亞型均無(wú)聯(lián)系（圖3C）,。與腫瘤和正常樣本共享的前三種經(jīng)典DC亞型不同，M06中幾乎所有細(xì)胞都來(lái)自腫瘤樣本,，這表明了LAMP3+DC亞群在腫瘤樣本中高度富集（圖3D）,。在TCGA數(shù)據(jù)集中的胃癌樣本中，LAMP3+DC的特征基因的平均表達(dá)也高得多（圖3E）,。最后,，為了探索胃癌中LAMP3+DC的起源，首先構(gòu)建了髓系簇的樹(shù)狀圖,，發(fā)現(xiàn)LAMP3+DC與cDC1和cDC2聚集在一起（圖3F）,，其次，對(duì)這三個(gè)亞群的軌跡生信分析表明,，LAMP3+DC可能是由胃癌中的cDC2和cDC1發(fā)展而來(lái)的（圖3G），單細(xì)胞調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)推斷和聚類(lèi)生信分析表明,，IRF1,、IRF2、NFKB1和NFKB2的活性在LMAP3+DC中上調(diào),，這表明IRF家族和NF-kB是DC分化和成熟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,。

圖3 胃癌骨髓細(xì)胞的異質(zhì)性

5. 胃癌中巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性

M09和M10是兩簇C1QC+巨噬細(xì)胞，其特征是多個(gè)C1Q基因和抗原呈遞基因的高表達(dá)（圖3B）,。M11具有多種干擾素誘導(dǎo)基因的高表達(dá),，例如ISG15、IFIT2和IFIT3（圖3C）,。在這四個(gè)巨噬細(xì)胞簇中,，M08在腫瘤樣本中顯著富集（圖3D），因此被指定為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）,。巨噬細(xì)胞通常分為促炎M1類(lèi)和抗炎M2類(lèi),，作者為了測(cè)試此處確定的巨噬細(xì)胞亞群是否符合經(jīng)典M1/M2模型，評(píng)估了這些巨噬細(xì)胞亞型的M1和M2特征的表達(dá),，生信分析結(jié)果顯示,，INHBA+簇（M08）和ISG15+簇（M11）表現(xiàn)出更高的M1特征，而C1QC+簇（M9和M10）表現(xiàn)出更高的M2特征（圖4A）,，這表明胃癌中巨噬細(xì)胞的體內(nèi)極化不能用M1/M2模型來(lái)解釋,。在比較TAMs和C1QC+巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)水平時(shí),，在INHBA+巨噬細(xì)胞中識(shí)別出49個(gè)上調(diào)基因，包括多種趨化因子,，IL6,，PTGS2，IL1RN和TIMP1（圖4B）,。在樹(shù)狀圖中,，INHBA+TAM和單核細(xì)胞位于單個(gè)分支中，這意味著該簇可能起源于腫瘤區(qū)域的浸潤(rùn)單核細(xì)胞（圖4D）,，并且免疫浸潤(rùn)生信分析表明,，在INHBA+TAM中，多種轉(zhuǎn)錄因子的活性特異性上調(diào),，包括RELB,、NFKB1、NFKB2等,。

圖4 胃癌巨噬細(xì)胞的分子特征

6.成纖維細(xì)胞在新生血管和腫瘤發(fā)展中起著重要作用

成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是TME中具有高度可塑性的細(xì)胞群,，但對(duì)于胃癌中成纖維細(xì)胞亞型和CAF（癌相關(guān)成纖維細(xì)胞）的定義尚未達(dá)成共識(shí)。研究在對(duì)3467個(gè)成纖維細(xì)胞重新分類(lèi)后總共獲得了11個(gè)成纖維細(xì)胞簇,，并將其中三個(gè)指定為CAF（圖5A）,。研究表示，F(xiàn)01和F02均表達(dá)ACTA2,，多個(gè)基因與肌肉收縮有關(guān)（包括ACTG2,、MYH11和PLN）（圖5B）。F01可以被注釋為周細(xì)胞,，表示該簇中RGS5和PDGFRB的高表達(dá)（圖5B-C）,。PDGFRB的免疫熒光染色顯示周細(xì)胞位于血管周?chē)▓D5D），并證實(shí)周細(xì)胞在腫瘤樣本中富集（圖5E）,。在該簇中觀察到幾種血管生成因子（包括ANGPT2,、CAV1、NOTCH3,、PDGFA,、EPAS1和THY1）的表達(dá)增加。值得注意的是,，PDGFRB高表達(dá)的胃癌患者在TCGA中預(yù)后不良,。因此，該簇在胃癌的新生血管中起著至關(guān)重要的作用,，并且生信分析結(jié)果表明,，LRRFIP1、ETS1,、EPAS2,、MEF2C和SSRP1為上調(diào)的,。

F03是正常樣本中的主要成纖維細(xì)胞亞群（圖5D），以CXCL14,、POSTN,、F3、PDGFRA和SOX6的高表達(dá)為標(biāo)志,。該簇的表達(dá)特征類(lèi)似于人類(lèi)結(jié)腸中間充質(zhì)細(xì)胞的S2亞群,，該亞群與結(jié)腸的上皮單層非常接近，并被認(rèn)為在維持上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了一些作用,。研究觀察到腫瘤組織中該亞群顯著減少,，這可能反映了腫瘤中上皮屏障的功能障礙。F06主要來(lái)源于正常樣品,，以CFD,、CLU、COL14A1和PI16的高表達(dá)為標(biāo)志,。COL14A1+成纖維細(xì)胞已在多個(gè)人體組織的單細(xì)胞研究中得到鑒定,，包括人肺和結(jié)腸組織，這表明了該簇可能代表多個(gè)組織中常見(jiàn)的成纖維細(xì)胞亞型,。一組ECM分子（DCN,、DPT、FBLN1,、FBLN2,、GSN和TNXB）在該簇中高度表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)多個(gè)補(bǔ)體因子在該簇中高度表達(dá)（圖5C）,，這意味著該成纖維細(xì)胞亞群在先天免疫防御中發(fā)揮了一些作用。F04,、F05和F08在腫瘤樣本中顯著富集,，因此被表示為CAF的三個(gè)亞群。F04特異性表達(dá)CTHRC1（圖5C）,，其在胃癌中過(guò)度表達(dá),，并與不良預(yù)后相關(guān)。CTHRC1的免疫熒光染色顯示,，在胃癌中,，CTHRC1+細(xì)胞的位置是內(nèi)皮細(xì)胞周?chē)▓D5E）。GSVA富集生信分析表明,，該簇在ECM重塑相關(guān)通路中具有高活性,，包括“彈性纖維形成”、“基質(zhì)金屬蛋白酶激活”和“膠原蛋白降解”,。F05是COL14A1+成纖維細(xì)胞簇,，其特征是C7和APOD的高表達(dá)（圖5C）,。F08特異性表達(dá)MMP1、MMP3和MMP9,。轉(zhuǎn)錄因子TWIST1在F08中高度表達(dá),，已被證實(shí)為癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

圖5 胃癌中成纖維細(xì)胞的分布

7. 腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞顯示出高活性的血管生成

研究檢測(cè)到1873個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞,，其中大部分（88.2%）來(lái)自腫瘤樣本,，腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的重新分類(lèi)顯示了九個(gè)不同的簇（圖6A）。

圖6 胃癌內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞組成

E01是具有特異性表達(dá)尖端細(xì)胞標(biāo)記物（包括ESM1,、KDR和PDGFB）的尖端樣細(xì)胞（圖6B-C）,，在該簇中觀察到。在TCGA中,，胃癌樣本中這些特征基因的表達(dá)更高,，表明胃癌中的血管生成非常活躍（圖6D）,。上調(diào)基因的GO富集生信分析表明“血管生成”和“白細(xì)胞趨化性”在該簇中富集,。E02和E03具有ACKR1和SELP的高表達(dá)（圖6C），因此可以被指定為靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,，在TCGA數(shù)據(jù)集中,，ACKR1基因高表達(dá)的胃癌患者預(yù)后不良（圖6E）。E04高表達(dá)CD36和CA4（圖6C）,，代表毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,。E05高表達(dá)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的多種標(biāo)記物（GJA5、GJA4,、SEMA3G和HEY1）,。E07表達(dá)了許多干擾素誘導(dǎo)的基因（例如CXCL10、CXCL11,、ISG15和IFIT3）,。E09表示淋巴EC為L(zhǎng)YVE1，CCL21在該簇中特異表達(dá),。

8. 內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在腫瘤血管生成中的相互作用增強(qiáng)

研究使用CellPhoneDB2,，確定了腫瘤和正常樣本中由各種配體和受體對(duì)介導(dǎo)的潛在細(xì)胞間相互作用，在正常樣本中,，三類(lèi)髓樣細(xì)胞中的細(xì)胞間相互作用略微富集（圖7A）,。內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的緊密相互作用表明，成纖維細(xì)胞與腫瘤血管生成和腫瘤血管系統(tǒng)的維持密切相關(guān),。除此之外,，當(dāng)檢查不同內(nèi)皮細(xì)胞亞群和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞間相互作用時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)EC-ESM1（尖端樣內(nèi)皮細(xì)胞）與四個(gè)成纖維細(xì)胞亞群（F01-F04）具有強(qiáng)烈的相互作用（圖7B）,。EC-ESM1與這四個(gè)成纖維細(xì)胞亞群的相互作用主要由PGF,、VEGFA,、PDGF基因及其受體介導(dǎo)（圖7C），這些基因是血管生成的已知驅(qū)動(dòng)因子,。奇怪的是,，F(xiàn)LT1和PGF的相互作用僅在EC-ESM1和Fib-RGS5中觀察到，而在其他對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞簇中沒(méi)有觀察到,?？傊瑑?nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞相互作用的增強(qiáng)是胃癌細(xì)胞間相互作用的根本改變,。

圖7 胃癌中的細(xì)胞相互作用

9.前三項(xiàng)研究的重復(fù)性分析

三個(gè)已發(fā)表的scRNA序列數(shù)據(jù)集（PMID 32532891,、34385296和34933901）用于驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中確定的細(xì)胞亞群可以代表胃癌的細(xì)胞雜合度。PMID 32532891,、PMID 34385296和PMID 34933901中確定的T細(xì)胞亞群的UMAP圖,，其中在所有三項(xiàng)生信分析研究中都發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞,、CD8+T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞,，顯示了這些已發(fā)布的胃癌單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中的髓樣細(xì)胞聚類(lèi)，在三個(gè)數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)了15個(gè)聚類(lèi),。此外,，研究還分析了胃癌的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，大多數(shù)亞型與研究結(jié)果相似,。