自身免疫性疾病是機(jī)體對自身抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病。機(jī)制是復(fù)雜的,，通常受到細(xì)胞或蛋白質(zhì)水平上的許多相互作用以及重要的細(xì)胞內(nèi)通路的嚴(yán)格調(diào)控,。盡管這種復(fù)雜性成為自身免疫疾病研究中的難題，但是復(fù)雜的相互作用、介質(zhì)和信號通路均可提供藥物發(fā)現(xiàn)的靶點(diǎn),。

細(xì)胞因子是炎癥的主要介質(zhì),。自身免疫性疾病研究中最成功的方法之一是篩選抑制其分泌或阻斷其受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物，從而降低整體炎癥反應(yīng),。其中研究最多的有白細(xì)胞介素和趨化因子,。

細(xì)胞因子抑制篩選
IL-17是一種由Th17表達(dá)的促炎細(xì)胞因子，在多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中的重要的效應(yīng)因子,。已經(jīng)證實(shí),，抑制IL-17可以減輕上述疾病的癥狀，使其成為藥物發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要靶點(diǎn),。

圖1：HTRF細(xì)胞因子檢測的原理

2011年，F(xiàn)ujita-Sato等人通過TR-FRET試驗(yàn),，篩選了約700種不影響IFNγ分泌的IL-17抑制劑化合物,。該實(shí)驗(yàn)使用地高辛能夠作為IL-17表達(dá)的抑制劑，而不影響IFNγ的分泌(圖2A和2B),。地高辛與RORγt結(jié)合,，成功地抑制了Th0細(xì)胞向Th17的分化。

圖2A：在地高辛刺激下,，CD4+細(xì)胞中IL-17和IFNγ的表達(dá)水平,。

圖2B：地高辛刺激或無刺激時(shí)，伊屋諾霉素和PMA刺激Th17和Th1中IL-17的表達(dá)水平

基于Fujita-Sato團(tuán)隊(duì)的發(fā)現(xiàn),，Takaishi等人旨在開發(fā)一種RORγt拮抗劑來抑制銀屑病中的Th17分化和IL-17表達(dá),。他們通過監(jiān)測Th0分化為Th17和TR-FRET檢測IL-17和IFNγ的表達(dá)水平。研究結(jié)果表明,，A213是一種新的RORγt激動劑,，其效果強(qiáng)于Fujita-Sato所描述的地高辛（圖3）。

圖3：地高辛和A213濃度增加,，Th17的抑制率變化

使用銀屑病小鼠模型中研究A213對銀屑病的作用,，結(jié)果顯示銀屑病樣癥狀得到緩解，如皮膚損傷和炎癥,。HTRF技術(shù)檢測的IL-17在皮膚炎癥區(qū)域分泌減少（圖4）,。表明A213在銀屑病中治療中具有潛在抑制效果。

圖4：A213對TPA誘導(dǎo)的小鼠耳朵銀屑病樣癥狀的影響,。甲基纖維素(MC)作為控制劑,。

2013年，Dobritsa等人開發(fā),、優(yōu)化并驗(yàn)證了一種與HTS兼容的TR-FRET檢測方法,，用于篩選IL-17和/或Th17抑制劑。使用HTRF IL-17試劑盒，他們評估了HTS兼容96和384板格式的可靠性,，得出了該系統(tǒng)的穩(wěn)健性,、易用性和鑒別效力。

通過對雷帕霉素和環(huán)孢霉素A的劑量-反應(yīng)分析進(jìn)一步驗(yàn)證,，這兩種化合物被稱為IL-17抑制劑,，在本研究中首次測定了其體外效價(jià)(IC50分別為80±23pM和223±52nM)（圖5）。

最后,，通過該方法可以鑒定出IKK16作為IL-17產(chǎn)生的抑制劑,，半抑制濃度為315±79nM。

圖5：雷帕霉素,、環(huán)孢霉素A和IKK16的劑量-反應(yīng)曲線,。

細(xì)胞因子和受體的阻斷劑篩選
文獻(xiàn)記載集中于研究細(xì)胞因子分泌的抑制劑，但是通過阻斷細(xì)胞因子和其受體結(jié)合或傳導(dǎo)信號通路來降低細(xì)胞因子的活性,，這一方法也是值得研究的,。

IL-21是一種主要由CD4+T細(xì)胞和NKT細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。以慢性炎癥為特征的自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中多有IL-21的分泌,，如狼瘡,、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病。中和IL-21的生物活性已經(jīng)被證明可以減少這些疾病的癥狀,。

2010年,，Vugmeyster等人尋求開發(fā)適合于抑制IL-21R的抗體。使用噬菌體展示方法,，他們從18A5抗IL-21R抗體中獲得許多抗體變體(單鏈變異片段或ScFv）,。這些ScFv通過HTRF競爭實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選。生物素標(biāo)記的IL-21R和XL665標(biāo)記的鏈霉親和素和Eu標(biāo)記的抗IL-21R抗體,，抗體與IL-21R結(jié)合,，這使Eu和XL665接近，光激發(fā)Eu觸發(fā)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）,。加入的ScFv與抗IL-21R抗體競爭,，從而信號下降（圖6）。

圖6：競爭實(shí)驗(yàn)檢測原理圖

通過分析,，能夠識別出一組潛在的抗體變體,，其中兩個(gè)抗體只有四個(gè)氨基酸不同。對這兩種抗體在小鼠狼瘡模型中的進(jìn)一步研究和測試,，在藥理活性和藥效學(xué)特征方面,，這些抗體的非常微小的變化可能導(dǎo)致顯著的體外和體內(nèi)效應(yīng)。

細(xì)胞因子為自身免疫性疾病中的藥物發(fā)現(xiàn)提供了多個(gè)篩選靶點(diǎn),。HTRF分析已經(jīng)成功地用于解決藥物篩選,，并具有滿足高通量的需求，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)短（2小時(shí)），樣本消耗少,，操作簡單,，無洗滌，靈敏度高,，動態(tài)范圍寬等優(yōu)勢,。