樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是先天免疫系統(tǒng)不可分割的組成部分,，在免疫激活中發(fā)揮著重要的作用,。在哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中，至少有兩類(lèi)樹(shù)突狀細(xì)胞,，髓系樹(shù)突狀細(xì)胞（cDC）和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(pDC),。另外，DC也可以分化為耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞（TolDC）,，其具有穩(wěn)定,、半成熟表型和耐受性等屬性，可以消除免疫反應(yīng),，限制T細(xì)胞的免疫發(fā)生,，以維持和促進(jìn)T細(xì)胞的耐受性。TolDC療法被認(rèn)為是多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中自身免疫性或慢性炎癥性疾病治療的替代或輔助方法,。

本文提供一個(gè)詳細(xì)的骨髓來(lái)源DC細(xì)胞的獲取,，誘導(dǎo)細(xì)胞分化為T(mén)olDC以及相關(guān)功能評(píng)價(jià)的方法。

圖1：DC細(xì)胞的耐受機(jī)制

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

一,、 原代骨髓單細(xì)胞懸液制備

1.      通過(guò)高壓滅菌消毒所有手術(shù)器械，在二類(lèi)生物安全柜中,，采用適當(dāng)?shù)陌踩绦蜻M(jìn)行實(shí)驗(yàn),。

2.      使用CO2對(duì)8-10周齡的C57BL/6小鼠實(shí)施安樂(lè)死,將小鼠放在解剖板上，用70%的乙醇沖洗,用手術(shù)剪刀切除脛骨-腓骨和股骨,，置于有70%乙醇的10厘米培養(yǎng)皿中,。

3.      用手術(shù)刀片和鑷子剔除組織，分離脛骨和股骨,，置于有70%乙醇的6cm培養(yǎng)皿中,。

4.      使用手術(shù)刀片來(lái)修剪脛骨和股骨的兩端。用裝有3mLPBS的23G針頭的注射器,，將骨髓內(nèi)容物從骨的一端沖洗到含有12mlPBS的錐形管中。骨骼每端重復(fù)3次,。

5.      將細(xì)胞懸液以300xg離心5min,。

6.      棄上清，加1ml紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞,，裂解5min,，去除紅細(xì)胞。

7.      加9mlPBS,，300xg離心5min,。

8.      棄上清，用10ml培養(yǎng)基(RPMI-1640+L-谷氨酰胺,、10% FBS,、1%非必需氨基酸、10mM HEPES,、50 nM β-巰基乙醇和5%青霉素/鏈霉素)重懸,。

注：FBS中的內(nèi)毒素水平必須小于0.1EU/ml。

9.      將細(xì)胞懸液用40μm濾器過(guò)濾,，取20μl細(xì)胞懸液,，與80μl臺(tái)盼藍(lán)混合，細(xì)胞儀計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量,。

二,、 體外誘導(dǎo)骨髓，獲取BMDC

1.      用含15ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4的培養(yǎng)基,，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1x106個(gè)細(xì)胞/ml,。

2.      6孔板鋪板，每孔3ml1x106個(gè)細(xì)胞/ml,，在37°C,、5%CO2,、95%濕度的CO2培養(yǎng)箱中孵育

注：一只小鼠的骨髓細(xì)胞約為3-5x107細(xì)胞，即可以鋪2到3 個(gè)6孔板,。

3.      培養(yǎng)第3天,，去除孔中培養(yǎng)基，每孔中加入2ml新鮮PBS,，然后輕輕旋轉(zhuǎn)平板,，確保去除所有非貼壁細(xì)胞。

4.      每孔加入3ml含15ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。

5.      培養(yǎng)第5天,，每孔再加入3ml含15ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

注：此時(shí)每孔體積為6ml,。

6.      培養(yǎng)第7天,，將整個(gè)板子放在冰上10min。用移液器輕輕的吸去培養(yǎng)基,，從而得到松散粘附的BMDC,，視為未成熟DC（iDC）。

注意：粘附的巨噬細(xì)胞仍附著在培養(yǎng)皿上,。低溫和溫和的步驟是避免DC細(xì)胞激活,，從而影響進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。

7.      將細(xì)胞懸液300xg離心5min,，用新鮮培養(yǎng)基重懸,，等待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

注：通過(guò)流式細(xì)胞術(shù),，用熒光標(biāo)記的CD11c抗體來(lái)鑒定BMDC的誘導(dǎo)效果

圖2：BMDC的分化過(guò)程和表型特征鑒定

三,、 TolDC的體外誘導(dǎo)及鑒定

1. 在6孔板中,，每孔加入2ml 含100-400 nM CDDO-DFPA的培養(yǎng)基,，1x106 /ml的BMDC，培養(yǎng)箱中孵育1h,。

注：CDDO-DFPA是一種合成的三萜類(lèi)藥物,，也可以用其他已知藥物將iDC中誘導(dǎo)成TolDC,，如IL-10、維生素D3,、地塞米松或BAY11-7085,。

2. 加入10或100ng/ml的LPS，孵育4-24h,，誘導(dǎo)成熟mDC(孵育時(shí)間因mRNA或蛋白質(zhì)測(cè)定而不同),。

3. 用1ml移液管輕輕收集細(xì)胞懸液。300xg離心5min，分別收集細(xì)胞和上清液,。

4. 流式分析細(xì)胞表面抗原（如刺激抗原：CD40,、CD80、CD86,、MHC-II,、OX40L、ICOSL,，或抑制性抗原：PD-L1,、PD-L2、ILT3,、ILT4）,。

5. 提取RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，CBA多因子檢測(cè)分析上清樣本中的細(xì)胞因子（如炎癥細(xì)胞因子：TNF-α,、IFNγ,、IL-6、IL-12和IL-23,，或抗炎細(xì)胞因子：IL-4,、IL-10、IL-15,、TGF-β1）。

DC表面標(biāo)記

圖3：DC部分表面蛋白表達(dá)結(jié)果

四,、TolDC的體外功能評(píng)價(jià)

1.    通過(guò)磁珠分選得到小鼠脾臟來(lái)源的CD4 +T細(xì)胞,。

2.    用1μM CFSE標(biāo)記CD4+T細(xì)胞(1x107/ml)15分鐘，用PBS洗滌,，調(diào)整終濃度為2x106T細(xì)胞/ml,。

3.    96孔板中，用100μl（2x105 /ml）TolDC與相同體積的CFSE標(biāo)記CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)（即最終數(shù)量比為1:10）,，每孔加入100ng/mL卵清蛋白肽(323-329),，在孵育2-3天后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞的CFSE強(qiáng)度,。

注：卵清蛋白肽(323-329)代表 OVA 的 T 和 B 細(xì)胞表位,，引起小鼠的即時(shí)超敏反應(yīng)

圖4：TolDC對(duì)T細(xì)胞的增殖抑制（w/—with;w/o—without）

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