今天給大家推出的是PBMC系列的最后一類細胞——巨噬細胞

關(guān)于巨噬細胞的內(nèi)容比較多,，今天只給大家介紹了人源巨噬細胞的相關(guān)內(nèi)容，下一期還會針對鼠源巨噬細胞進行介紹

透露一下下一期的大致內(nèi)容包括：小鼠各種來源（骨髓,、腹腔,、肺泡,、脂肪組織）巨噬細胞的分離及體外培養(yǎng),，以及巨噬細胞功能的評價 現(xiàn)在，先讓我們來了解一下與人巨噬細胞相關(guān)的知識

01巨噬細胞簡介巨噬細胞是一種廣泛分布于全身血液,、組織的免疫細胞,，起源自單核細胞，而單核細胞則又來源于骨髓中的前體細胞 作為單核吞噬細胞系統(tǒng)中的一部分,，巨噬細胞可以吞噬,、殺滅病原菌等異物；能夠分泌參與炎癥反應(yīng)的生物活性介質(zhì),；并且攝取并處理抗原,，并把抗原信息遞呈給淋巴細胞等 巨噬細胞在體內(nèi)分布廣泛，主要分布于疏松結(jié)締組織,、肝,、脾,、淋巴結(jié)、骨髓,、腦,、肺以及腹膜等處，并依其所在組織的不同而有不同的名稱 比如肝臟中枯否細胞,，骨髓中的破骨細胞,，大腦神經(jīng)組織中的小膠質(zhì)細胞等

圖1 巨噬細胞的來源及組織分布示意圖（圖片來自“閑談 Immunology”公眾號，侵刪）

02巨噬細胞極化巨噬細胞具有很強的可塑性,，可以從一種表型轉(zhuǎn)換為另一種表型 我們可能經(jīng)常聽說過巨噬細胞極化,，指的就是巨噬細胞在不同的誘導(dǎo)刺激條件下發(fā)生特定的表型分型 按照其活化狀態(tài)不同，主要可以分為M1型巨噬細胞（經(jīng)典激活巨噬細胞）和M2型巨噬細胞（替代活化巨噬細胞） 但值得注意的是,，巨噬細胞的這兩種分型并沒有絕對意義上的對立,，也即M1和M2表型并非相互排斥，而是經(jīng)常共存的,，因此不能簡單地認為它們是完全不同的巨噬細胞群體 巨噬細胞極化標志物通常以不同水平表達在不同分型的巨噬細胞上,，并且不同分型的巨噬細胞在特定條件下能發(fā)生轉(zhuǎn)化

圖2 特定條件下巨噬細胞的分型轉(zhuǎn)化[1]

圖3 組織修復(fù)、再生和纖維化中驅(qū)動主要巨噬細胞活化表型的機制[2]在體內(nèi)傷口愈合基因表達中,，巨噬細胞在早期階段表現(xiàn)出促炎 M1 分泌譜,，高能力呈遞抗原、產(chǎn)生白細胞介素IL-12 和IL-23,，抑制細胞增殖并造成組織損傷 在后期愈合階段,，巨噬細胞則轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡?M2 基因表達譜，通過產(chǎn)生血管生成介質(zhì),，例如轉(zhuǎn)化生長因子-β （TGF-β）,、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和表皮生長因子（EGF）等，促進炎癥消退和傷口愈合 下圖給出了人/鼠巨噬細胞M0,、M1和M2極化的標志物

圖4 巨噬細胞極化標志物[3]巨噬細胞的極化受到諸多因素的影響：體外受脂多糖（LPS）和/或干擾素（IFN-γ）等促炎因子刺激時,，巨噬細胞易發(fā)生M1型轉(zhuǎn)化，這也是體外誘導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生M1極化的主要方法 此外,，M1型巨噬細胞還會分泌多種細胞因子,，包括IL-6、IL-12,、IL-1α以及TNF-α等 巨噬細胞體外受到IL-4,、IL-13等刺激時,，則容易發(fā)生M2型極化，其中,，TGF-β被認為是巨噬細胞M2表型維持中最重要的細胞因子之一 此外,，M2型巨噬細胞還可進一步分為四種亞群，包括M2a,、M2b,、M2c 下圖詳細描述了M1以及M2型巨噬細胞的不同生物學(xué)和生理學(xué)特征

圖5 在人和小鼠中觀察到的M1和M2巨噬細胞表型的不同生物學(xué)和生理學(xué)特征[4]

03人巨噬細胞體外培養(yǎng)巨噬細胞極化的體外研究，通常使用IFN-γ和LPS等TLR激動劑誘導(dǎo)M1型極化,，使用IL-4或IL-13等誘導(dǎo)M2型極化,，然后記錄基因表達、細胞表面標志物及蛋白質(zhì)含量和活性的變化 目前人巨噬細胞的體外培養(yǎng)主要由2種來源,，分別由無限增殖的單核細胞系THP-1或者原代分離的單核細胞誘導(dǎo)分化而來 1. THP-1細胞誘導(dǎo)分化THP-1細胞系是從一名患有急性單核細胞白血病的1歲小男孩的外周血中分離得到的,，自1980年建系以來，THP-1細胞被廣泛用于單核細胞和巨噬細胞相關(guān)的機制,、信號通路以及營養(yǎng)和藥物運輸?shù)妊芯恐?/p>

THP-1細胞可被佛波酯（PMA）誘導(dǎo)分化為巨噬細胞M0

（1）然后可再通過LPS和/或IFN-γ誘導(dǎo)發(fā)生M1極化,，進而釋放出TNF-α、IL-6等細胞因子,，這一過程可作為典型的炎癥模型

（2）或者通過 IL-4 ,、IL-13和巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）誘導(dǎo)發(fā)生M2極化，分泌TGF-β,、IL-10等抑制性細胞因子,，這一過程則類似于炎癥后期的組織修復(fù)和重建

THP-1細胞誘導(dǎo)分化成巨噬細胞步驟：

（1）將THP-1以5×105/孔接種到0.2%明膠包被的6孔細胞培養(yǎng)板中，5%CO2,，37℃恒溫培養(yǎng)過夜,；注：明膠包被實驗步驟將在后文中進一步說明，明膠可以促進巨噬細胞吸附,，該步驟也可直接在不包被明膠的普通6孔細胞培養(yǎng)板中進行

（2）PRMI-1640（含10%FBS）培養(yǎng)基中加入100 ng/mL PMA刺激THP-1細胞生長,，輕晃培養(yǎng)板至液體混勻，5%CO2,，37℃恒溫繼續(xù)培養(yǎng)48 h 待細胞貼壁后,，棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)基維持細胞生長,，得到THP-1-Mφ 在PMA繼續(xù)存在的情況下,，誘導(dǎo)巨噬細胞極化 注：PMA誘導(dǎo)時間可以根據(jù)細胞形態(tài)變化進行初步判斷 文獻[5]指出，THP-1細胞經(jīng)185 ng/mL PMA培養(yǎng)6 h后即可進行下一步極化誘導(dǎo) （3）M1極化：IFN-γ（20 ng/mL） LPS（100 ng/mL）誘導(dǎo)48 h以上,；M2極化：IL-4（20 ng/mL） IL-13（20 ng/mL）誘導(dǎo)48 h以上 極化完成后,，細胞用不含刺激物和PMA的無血清RPMI-1640重懸，可以維持72 h極化表型[5] 后續(xù)可根據(jù)自己的實驗需求開展相關(guān)實驗

注：THP-1細胞經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)處理48 h后,，由懸浮生長變成貼壁生長,，THP-1-Mφ高表達單核巨噬細胞特有的CD14和CD68分子,，細胞呈圓形或橢圓形，并有明顯的突觸,，對抗原攝取能力較弱 繼續(xù)分化為THP-1-M1/2后,，細胞表面出現(xiàn)明顯突起，可對病原體進行有效吞噬 并且從理論上說,，巨噬細胞屬于終末分化細胞,，不會再繼續(xù)增殖；同時巨噬細胞對胰酶不敏感,，消化巨噬細胞可嘗試用利多卡因或者直接用細胞刮刀 舉例：在這里,，和大家分享一篇文章，該文章介紹了PMA（100 nM）刺激THP-1細胞生長7天過程中細胞的變化情況：

圖6 PMA刺激培養(yǎng)7天THP-1細胞的變化情況[6]文章對該圖的解釋是：THP-1單核細胞在經(jīng)PMA共培養(yǎng)30 min左右即可粘附到基質(zhì)上,，在第一天可觀察到兩類細胞，第一類約占75-80%,，具有單核形態(tài)樣細胞,，在基質(zhì)上基本不鋪展（大小5-7 μm），細胞呈圓形,，核卵圓形（圖a）,；細胞表面有小突起和褶皺（圖e），未觀察到肌動蛋白束（圖i） 這類細胞群在整個實驗過程中都存在,，但到第5-7天時,，其占比降至7%以下 在分化的第3天，單核細胞樣細胞的比例下降至28-35% 其余的細胞群是直徑為20-40 μm的非極化細胞（41-45%）和具有細長突起（50-80 μm）和卵圓形或腎形細胞核的極化細胞（20-30%）（圖b） 此時,，所有極化細胞都含有肌動蛋白束,，這些肌動蛋白團占據(jù)了整個細胞質(zhì)，并沿細胞軸定向（圖j） 非極化細胞包含圓形位于細胞前緣區(qū)域的肌動蛋白束 這些細胞的表面不規(guī)則,，有褶皺和球形或滴狀突起（圖f） 在分化第5天,，具有長突起的直徑為60-120 μm的極化細胞（圖c）占優(yōu)勢（75-77%） 非極化細胞（15-17%）的大小增加到30-70 μm 細胞核大多呈腎形或多形性，這是巨噬細胞的典型特征 極化細胞包含沿突起平行排列的肌動蛋白束（圖k和l） 非極化細胞在前緣保留肌動蛋白微絲束 梭形細胞表面形成長褶皺（圖g）,，而非極化細胞表面有褶皺,、單個突起和褶皺（圖g和h） 到分化第7天，細胞的形態(tài)特征基本沒有變化,，表明細胞已獲得穩(wěn)定的形態(tài)表型（圖d,、h和l） 研究中PMA（100 nM）引起THP-1巨噬細胞形態(tài)類型發(fā)生連續(xù)變化，進而作者認為巨噬細胞分化具有三個主要的可識別階段：初始階段（單核細胞樣細胞）,、中間階段（非極化細胞）和終末階段（極化細胞）

此外,，除了細胞形態(tài)變化，文章還描述了該過程中細胞周期,、細胞因子表達,、細胞吞噬活性的變化,，大家感興趣的可以仔細閱讀文獻6 2. PBMC來源的巨噬細胞的分離和培養(yǎng)

圖7 人巨噬細胞分離和誘導(dǎo)分化流程示意圖（1）人PBMC分離：PBMC分離步驟見CD107a：免疫細胞活性評價的又一利器——CD107a 流式檢測方法與知識大放送一文

（2）單核細胞分離A：陰選——如利用美天旎的單核細胞分離試劑盒（Pan Monocyte Isolation Kit, Human），可以從人PBMC中分離出未吸附的單核細胞 該試劑盒是一種間接磁性標記系統(tǒng),，可以同時富集典型的CD14 CD16-,，非經(jīng)典的CD14 CD16 ，以及中間類型的CD14 CD16 三種類型的單核細胞 非單核細胞,，如T細胞,、NK細胞、B細胞,、樹突狀細胞和嗜堿性粒細胞,，使用生物素結(jié)合抗體和抗生物素微球的混合物進行間接磁性標記 通過去除磁性標記物可以獲得高純度的未標記單核細胞 具體步驟大家根據(jù)該試劑盒說明書進行操作即可

注：用試劑盒來分選單核細胞，效果自然是好,，但硬傷是傷錢呀,！小小的試劑盒就要好幾千大洋，導(dǎo)師怎么可能給我這個菜鳥買呢,？接下來,，給大家介紹兩種經(jīng)濟實惠的做法，不需要看導(dǎo)師的臉色,，我們就能輕易分離出單核細胞

B：明膠法分離單核細胞① 明膠包被細胞培養(yǎng)瓶：向一次性75 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中加入10 mL 2%的明膠溶液,，覆蓋整個底面，置于37℃干燥箱中約2 h,，吸出培養(yǎng)瓶中多余的明膠溶液,，置于37℃干燥箱至少2天才可使用 培養(yǎng)瓶經(jīng)此處理可以使用1個月之久 ② 用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整分離后的PBMC密度至1×106/mL，加入10 mL至細胞培養(yǎng)瓶中,，置于5%CO2,，37℃條件下培養(yǎng)2 h，然后移除非黏附的細胞 用預(yù)熱的PBS溶液小心洗滌未粘附的細胞,，棄去液體后,，向培養(yǎng)皿中加入10 mL含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于5%CO2,，37℃條件下培養(yǎng) 培養(yǎng)1天后,，可見大部分細胞脫落或者容易脫落，使用細胞刮刀將其刮下后,，轉(zhuǎn)移至離心管中,，室溫條件下250 g離心10 min，加入新鮮的培養(yǎng)基進行培養(yǎng) 注：明膠法分離單核細胞的原理可能是：單核-巨噬細胞能夠分泌一種與細胞膜有聯(lián)系的纖連蛋白,，這種蛋白能夠結(jié)合到各種類型的膠原上,，也包括變性的膠原——明膠

使用細胞刮刀會對細胞造成較大的機械損傷，也可以使用10 mM EDTA的無Ca2 、Mg2 的PBS溶液進行消化,，大約10-15 min可以觀察到細胞松散脫落 然后使用無Ca2 ,、Mg2 的PBS溶液洗滌細胞一次 若用該方法消化單核細胞，無需按照上述步驟將細胞再培養(yǎng)1天 C：貼壁法分離單核細胞

關(guān)于單核細胞的分離,，還有更加簡單粗暴的做法,，那就是直接用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基（補充2 mM的L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素以及100 μg/mL鏈霉素）貼壁培養(yǎng)PBMC（1×106/mL）2 h,，然后小心去除懸浮細胞,，以PBS溶液洗滌2次剩余的貼壁細胞即為單核細胞 缺點是該方法獲得的單核細胞純度較低 至此，我們已經(jīng)從PBMC中分離出單核細胞

注：以RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)這類單核細胞7天,，中間不換液并且不再補充外源性的物質(zhì),，可以誘導(dǎo)單核細胞自發(fā)分化形成M0型巨噬細胞[7] （3）巨噬細胞分化誘導(dǎo)

GM-CSF和M-CSF作為巨噬細胞誘導(dǎo)的啟動和激活因子，可分別誘導(dǎo)單核細胞向M1型（抗炎）以及M2型（抗炎）巨噬細胞分化,，促進其細胞因子分泌能力 將分離得到的單核細胞用含10 mL GM-CSF（10 ng/mL）或含M-CSF（25 ng/mL）的RPMI-1640（10% FBS）繼續(xù)培養(yǎng),，培養(yǎng)時控制細胞密度在1×106/mL左右 培養(yǎng)7天后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,，如下圖：

為了更好地促進巨噬細胞的極化,，我們可以在培養(yǎng)基中添加多種促極化因子，補充LPS（10 ng/mL） 人IFN-γ（5 U/mL）可以促進巨噬細胞的M1型極化,，此時細胞多呈紡錘形；補充IL-4（20 ng/mL）,、 IL-10（20 ng/mL）或地塞米松（10 μM）可以促進巨噬細胞M2型極化,，此時細胞多呈圓形 如下圖所示[8]：

文獻6的作者總結(jié)了不同培養(yǎng)方法對最后巨噬細胞極化以及標志物表達的影響，大家可以根據(jù)自己需要的條件進行選擇性設(shè)計培養(yǎng)方案

此外,，還有文章在獲得單核細胞后對其連續(xù)培養(yǎng)7天,，隨后使用LPS（1 μg/mL） 人IFN-γ（10 ng/mL）孵育48 h誘導(dǎo)M1極化（細胞多呈紡錘形）；使用IL-4（20 ng/mL） IL-13（5 ng/mL）培養(yǎng)48 h誘導(dǎo)M2極化（細胞多呈圓形）,，誘導(dǎo)結(jié)果如下圖[7] 極化完成后,，細胞用不含血清和PMA的無血清RPMI-1640重懸，可維持72 h的表型

具體實驗中各種刺激物的誘導(dǎo)濃度和時間還需要大家進行預(yù)實驗進行分析和確定

04參考文獻

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3. Boutilier, A.J. and S.F. Elsawa, Macrophage Polarization States in the Tumor Microenvironment. International Journal of Molecular Sciences, 2021. 22(13).

4. Shapouri-Moghaddam, A., et al., Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology, 2018. 233(9): p. 6425-6440.

5. Tedesco, S., et al.,Convenience versus Biological Significance: Are PMA-Differentiated THP-1 Cells a Reliable Substitute for Blood-Derived Macrophages When Studying Polarization? Frontiers In Pharmacology, 2018. 9: p. 71.

6. Kurynina, A.V., et al., Plasticity of Human THP-1 Cell Phagocytic Activity during Macrophagic Differentiation. Biochemistry. Biokhimiia, 2018. 83(3): p. 200-214.

7. Tedesco, S., et al.,Phenotypic activation and pharmacological outcomes of spontaneously differentiated human monocyte-derived macrophages.Immunobiology, 2015. 220(5): p. 545-554.8. Vogel, D.Y.S., et al., Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology, 2014. 219(9): p. 695-703.

以上就是今天和大家分享的所有內(nèi)容啦,，我們下期再見