許多分子生物學技術(shù)都需要高純度和高濃度的質(zhì)粒DNA作為基礎(chǔ),。本章將討論從細菌培養(yǎng)物中純化質(zhì)粒DNA的一般程序,。有關(guān)如何在平板上劃線以獲得單個菌落和產(chǎn)生液體細菌培養(yǎng)物的詳細信息可以參看之前推文。一些商業(yè)公司,,如Qiagen,、Invitrogen和Promega,出售分離質(zhì)粒DNA的試劑盒,,其數(shù)量低至幾mg至幾mg,,濃度范圍為150ng/ml至幾mg/ml。下面的方案旨在描述從細菌培養(yǎng)物中純化質(zhì)粒DNA的一般程序,。如果要使用提取試劑盒,請按照試劑盒的說明書進行操作,。如果想要在不使用試劑盒的情況下進行質(zhì)粒純化,,可以參考本文的方案。用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細菌過夜培養(yǎng)物1. 將含有質(zhì)粒的細菌培養(yǎng)過夜,。注意:參考適當?shù)腄NA提取準備方案,以確定細菌的生長量(低拷貝質(zhì)粒需要更多的細菌),。2.在進行DNA制備之前,,先離心培養(yǎng)物使細菌形成顆粒,沉淀,。提示:如果過夜培養(yǎng)物不能裝入一個離心管中進行收集,,那么可以將其等分放入數(shù)個管/瓶中離心,之后去除上清液并將細菌重新懸浮在緩沖液中,。注意:這一步需要完全重懸細菌,,但最好使用能夠與變性溶液完全反應(yīng)的最小體系重懸。注意:這一步會使細菌裂解,,將其內(nèi)含物(包括質(zhì)粒DNA)釋放到溶液中。注意:這一步會使pH值下降,,導致蛋白質(zhì)和基因組DNA沉淀,同時使較小的質(zhì)粒在溶液中游離,。5.離心分離蛋白質(zhì)和基因組DNA,,分離出含有質(zhì)粒的上清液。7.離心收集質(zhì)粒沉淀或使用柱子結(jié)合沉淀的DNA,。8.用70%乙醇清洗質(zhì)粒沉淀或柱子,以去除多余的鹽,。9.重懸質(zhì)粒,,或使用水或中性緩沖液(如TE)從柱上洗脫DNA。現(xiàn)在,你將擁有從細菌蛋白質(zhì)和基因組DNA中純化出來的質(zhì)粒DNA,。根據(jù)使用的方法,,對DNA濃度和純度的要求會有所不同。1.準備2ml含有質(zhì)粒的細菌過夜培養(yǎng)物,。2.向2 mL離心管中添加1.5 mL細菌過夜培養(yǎng)物。10000 g,,離心30秒,。倒出上清液,注意不要倒出沉淀,。3.使用100μl預(yù)冷的溶液I,,重懸細菌。渦旋2 min或直至所有細菌徹底重懸,。4.添加200μl溶液II,,輕柔的將離心管顛倒5次,以混勻內(nèi)容物,。隨著蛋白質(zhì)和DNA的變性,,內(nèi)含物會變得清晰和粘稠。注意:在此階段請勿渦旋,,否則基因組DNA將被切斷,,從而污染質(zhì)粒DNA。6.添加150μl預(yù)冷的溶液III,。輕柔的顛倒幾次混勻。將形成白色沉淀,,其中包含細菌蛋白質(zhì)和基因組DNA,。注:沉淀中含有蛋白質(zhì)、細胞碎片,、鹽和溶液中的其他額外沉淀,。9.通過移液器或小心傾倒將上清液收集到新的離心管中,。10.(可選)向上清液中添加5μL 2 mg/ml RNase A,,并在37°C孵育5 min。注:RNase A是一種胰腺核糖核酸酶,,可消化單鏈RNA,。11.(可選)進行苯酚-氯仿萃取。(見:三、DNA樣品的酚氯仿提?。?/span>注:苯酚-氯仿萃取去除DNA樣本中殘留的污染蛋白質(zhì)和RNase A,。當苯酚與含有DNA的水溶液混合時,蛋白質(zhì)將進入苯酚相中,,并與水相DNA分離,。12.向溶液中添加700μL預(yù)冷的100%乙醇或350μL室溫異丙醇以沉淀質(zhì)粒DNA。注意:如果用乙醇沉淀,,通常認為在-20°C或-80°C下孵育20 min或過夜可沉淀最大化,。14.(可選)用70%乙醇清洗沉淀,。(見:四,、乙醇沉淀)注:此步可去除沉淀中多余的鹽離子,可避免一些常見反應(yīng)出現(xiàn)問題,。16.用25-50μl的TE重懸質(zhì)粒,。1.向含DNA樣品的水相中加入等量的飽和苯酚氯仿。注意:如果DNA重懸在水中可進行次步驟,,DNA重懸在TE中則不可使用,。3.室溫,,最高轉(zhuǎn)速離心5 min,。中間相——可能出現(xiàn)白色層,,由沉淀的蛋白質(zhì)組成4.用移液器吸取含DNA的水相,,并轉(zhuǎn)移至新離心管。1.向DNA溶液中添加2-2.5倍體積的95%或100%乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉(pH值4.8),。顛倒離心管混勻。2.(可選)在-20°C下過夜或-80°C下放置30 min,。3.在4°C下高速(至少12000 rpm)離心,15-30 min,。4.棄上清液,。在紙巾上打開并倒置管子,,將多余液體排出。5.添加500μl預(yù)冷的70%乙醇清洗沉淀,。注意:這一步有助于去除DNA沉淀中多余的鹽離子,。6.在室溫下高速(至少12000 rpm)離心,5 min,。注意:千萬小心!在70%乙醇清洗后,,沉淀更難看到,,也更易脫離離心管。如果擔心沉淀丟失,,也可以用移液器將上清液從離心管中吸出,。8.用真空泵干燥或用紙巾倒置干燥5-20 min。9.用TE(10 mM Tris-HCl pH 8,,0.1 mM EDTA)或水重懸質(zhì)粒DNA,。注意:DNA重懸需要時間,最好在室溫下放置數(shù)小時至一夜,,然后再進行定量和使用,。10.將DNA儲存在4°C或-20°C下。以備后續(xù)實驗,。
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